P38MAPK信號(hào)通路對(duì)缺血預(yù)處理減輕神經(jīng)元凋亡作用機(jī)制的研究

李昕華，劉艷華，藺 勇

(長(zhǎng)春市中心醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130051)

星形膠質(zhì)細(xì)胞比神經(jīng)元更能耐受缺血損傷，在應(yīng)激狀態(tài)下被激活，通過(guò)抗氧化、減輕興奮性毒性、調(diào)節(jié)軸突再生對(duì)神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)作用.研究[1-2]表明：缺血缺氧后，腦內(nèi)產(chǎn)生的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)及其受體增多，對(duì)受損腦組織起到保護(hù)作用.前期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)：缺血預(yù)處理能增加星形膠質(zhì)細(xì)胞GDNF的表達(dá).本實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺血預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞制備出條件培養(yǎng)基(ACM)，沉默GDNF基因后制備另一種ACM，將缺血預(yù)處理的神經(jīng)元培養(yǎng)在不同ACM中，檢測(cè)神經(jīng)元凋亡及p-P38MAPK蛋白表達(dá)，應(yīng)用P38MAPK的抑制劑SB203580檢測(cè)神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)，探討缺血預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF抑制神經(jīng)元凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.

1 材料和方法

1.1 材 料

Wistar大鼠(吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；高糖DMEM 干粉培養(yǎng)基、胎牛血清及馬血清(GIBCO公司，美國(guó))；EGFP表達(dá)質(zhì)粒(武漢晶賽生物技術(shù)公司)；兔抗單克隆p-P38 MAPK一抗(Cell Signaling公司，美國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(Santa Cruz公司，美國(guó))；兔抗大鼠Caspase-3一抗(Boster公司，美國(guó))；吖啶橙、溴化乙啶(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；SB203580(Sigma公司，美國(guó)).

1.2 制備條件培養(yǎng)基

大鼠皮層神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪模型制備見(jiàn)本課題組前期研究[3-4].

取正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM1；前期實(shí)驗(yàn)[5]研究發(fā)現(xiàn)：OGD預(yù)處理及再缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF，再灌注24 h時(shí)表達(dá)最高，取這一時(shí)間點(diǎn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM2；利用EGFP表達(dá)質(zhì)粒沉默GDNF基因，轉(zhuǎn)染的星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注24 h后GDNF沉默效果最佳，選取此時(shí)的培養(yǎng)基，離心15 min后取上清，即為ACM3.將神經(jīng)元分為對(duì)照組、預(yù)處理組、預(yù)處理+缺血組、缺血組4組，分別用3種條件培養(yǎng)基孵育4組神經(jīng)元，24 h后應(yīng)用吖啶橙/溴化乙啶(acridine orange/ethidium bromide，AO/EB)熒光染色法測(cè)定神經(jīng)元凋亡情況.用生理鹽水將AO配制成 10 mg/mL，用蒸餾水將EB配制成5 mg/mL，V(AO)∶V(EB)∶V(PBS)按1∶2∶97混勻后應(yīng)用.將神經(jīng)元消化成單細(xì)胞懸液后用AO/EB熒光染液染色，熒光顯微鏡下觀察、拍照.計(jì)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞大小、細(xì)胞核染色、細(xì)胞核形狀、凋亡小體等分出活細(xì)胞數(shù)(VN)、早期凋亡細(xì)胞(VA)、晚期凋亡細(xì)胞(NVA)和壞死細(xì)胞(NVN).細(xì)胞凋亡率=(VA+NVA)/(VN+VA+NVA+NVN)×100%.

1.3 神經(jīng)元p-P38MAPK的檢測(cè)

用3種條件培養(yǎng)基孵育4組神經(jīng)元24 h后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)神經(jīng)元p-P38MAPK的表達(dá)情況.將神經(jīng)元用PBS洗滌2次，裂解細(xì)胞后收集上清蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒測(cè)定蛋白濃度.配制SDS-PAGE膠，將蛋白加入加樣槽后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將第一抗體按1∶800稀釋后加入放置NC膜的封閉袋中，4 ℃靜置過(guò)夜.將第二抗體按1∶1 000稀釋后放入封閉袋中，37 ℃孵育1 h.按照DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物試劑公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描電泳結(jié)果，進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算P38MAPK與GAPDH光密度的比值，得出蛋白質(zhì)水平.

1.4 神經(jīng)元Caspase-3的檢測(cè)

將SB203580加入ACM3中，使其終濃度為10 μmol/L，制備成ACM4，將ACM1、ACM2、ACM4分別加入4組神經(jīng)元中，再培養(yǎng)24 h，Western Blot檢測(cè)神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá).檢測(cè)方法同1.3.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)元凋亡率檢測(cè)結(jié)果

每組均可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，預(yù)處理+缺血組和缺血組可見(jiàn)凋亡小體和橙色熒光染色的凋亡細(xì)胞，明顯多于其他兩組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺血組可見(jiàn)不均勻橙紅色的壞死細(xì)胞較多，預(yù)處理+缺血組凋亡細(xì)胞較缺血組少(P<0.05)，ACM2組細(xì)胞凋亡率低于ACM1和ACM3兩組.結(jié)果見(jiàn)表1、圖1.

表1 AO/EB染色法測(cè)定神經(jīng)元凋亡率Tab.1 Neuron apoptosis rate examined by AO/EB staining

2.2 各組神經(jīng)元p-P38MAPK蛋白表達(dá)

在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下，預(yù)處理+缺血組及缺血組p-P38MAPK的蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和預(yù)處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下，預(yù)處理+缺血組p-P38MAPK的蛋白表達(dá)均較缺血組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).加入ACM2組的p-P38MAPK蛋白表達(dá)低于ACM1和ACM3兩組，ACM1組的表達(dá)較ACM3組稍低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)果見(jiàn)表2、圖2.

表2 神經(jīng)元p-P38MAPK的表達(dá)Tab.2 Expression of p-P38MAPK in neuron

2.3 各組神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)

在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下預(yù)處理+缺血組及缺血組神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和預(yù)處理組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；預(yù)處理+缺血組神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)均較缺血組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).ACM1組的Caspase-3蛋白表達(dá)高于ACM2和ACM4兩組，ACM4組表達(dá)與ACM2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).結(jié)果見(jiàn)表3、圖3.

表3 神經(jīng)元Caspase-3的表達(dá)Tab.3 Expression of Caspase-3 in neuron

3 討 論

缺血缺氧引起細(xì)胞出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，既可引起神經(jīng)元壞死，也可造成神經(jīng)元凋亡[6].熒光法對(duì)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)較敏感，能清楚地區(qū)分壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞.AO和EB雙染時(shí)，AO透過(guò)活細(xì)胞膜嵌入DNA，EB只透過(guò)死亡細(xì)胞.正常細(xì)胞核和凋亡早期細(xì)胞核均被染成綠色，但早期凋亡細(xì)胞可見(jiàn)凋亡小體，以此與正常細(xì)胞相區(qū)別；晚期凋亡細(xì)胞核被染成橙紅色，呈固縮狀或片段狀；死亡細(xì)胞呈均勻紅色，正常結(jié)構(gòu)破壞.本研究結(jié)果顯示：缺血組的死亡細(xì)胞最多，預(yù)處理+缺血組和缺血組的神經(jīng)元凋亡率明顯高于其他兩組，證明由于缺血直接導(dǎo)致了神經(jīng)元凋亡和壞死；缺血組的神經(jīng)元凋亡率明顯高于預(yù)處理+缺血組，ACM2組神經(jīng)元凋亡率低于另外兩組，說(shuō)明預(yù)處理誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞GDNF的表達(dá)增加，凋亡減少.

MAPK經(jīng)過(guò)典型的3級(jí)磷酸化激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活P38(p-P38MAPK)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，調(diào)控細(xì)胞存活或炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制P38 MAPK使組織缺血/再灌注損傷得到保護(hù)[7-8].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在預(yù)處理+缺血組及缺血組p-P38MAPK的蛋白表達(dá)均增多，說(shuō)明在神經(jīng)元缺血及缺血預(yù)處理后，P38MAPK通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化為p-P38MAPK，從而參與細(xì)胞凋亡.在任何一種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)下預(yù)處理+缺血組p-P38MAPK均較缺血組低，提示缺血預(yù)處理是通過(guò)抑制P38MAPK信號(hào)通路減輕神經(jīng)元凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用.加入ACM2的p-P38MAPK蛋白表達(dá)低于ACM1和ACM3兩組，說(shuō)明缺血預(yù)處理后星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF能夠抑制P38MAPK信號(hào)通路的激活，從而減少神經(jīng)元凋亡，起到神經(jīng)保護(hù)的作用.

蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程參與細(xì)胞凋亡[9]，Caspase家族成員在這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用.在出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，Caspase-8蛋白首先被激活，激活的Caspase-8蛋白又可作用于自身或Caspase-3，形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致下游的靶蛋白水解、細(xì)胞凋亡.P38MAPK抑制劑有上百種[10]，其中以SB203580的應(yīng)用最為廣泛.SB203580是P38MAPK的特異性抑制劑，抑制 SAPK2a/P38 和 SAPK2b/P38β2，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制ATP結(jié)合位點(diǎn)T106，使P38失去與ATP結(jié)合的能力，進(jìn)而失去激酶活性，從而抑制P38MAPK通路的激活程度[11].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SB203580制備條件培養(yǎng)基，孵育神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)預(yù)處理+缺血組及缺血組神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯高于對(duì)照組和預(yù)處理組，證明Caspase-3參與了缺血導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡.預(yù)處理+缺血組神經(jīng)元Caspase-3蛋白表達(dá)均較缺血組低，說(shuō)明缺血預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞可抑制Caspase-3表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元凋亡.ACM1組Caspase-3蛋白表達(dá)高于ACM2和ACM4兩組，表明缺血預(yù)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF抑制了Caspase-3的表達(dá)，并參與保護(hù)神經(jīng)元發(fā)生缺血損傷.ACM2組與ACM4組Caspase-3表達(dá)相同，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF通過(guò)抑制p-P38MAPK信號(hào)通路而減輕凋亡基因Caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用.