毛櫻桃炎痛貼的制備及活性研究

古 虹，范紫微，鄒天琪，張錚旭，孫利娟，陳 曦，張成義

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

貼劑是將天然藥物或有機(jī)化學(xué)合成藥物與適宜的基質(zhì)混合，采用相關(guān)制備工藝制成供機(jī)體表面外敷且能夠進(jìn)入全身血液循環(huán)進(jìn)而治療相關(guān)疾病的外用制劑[1].貼劑中藥的作用方式是藥物與相關(guān)基質(zhì)混合后容易透過(guò)皮膚，并通過(guò)毛細(xì)血管吸收后進(jìn)入全身血液循環(huán)，進(jìn)而對(duì)機(jī)體的病變部位起到治療作用[2].

毛櫻桃炎痛貼(Prunustomentosathumb Yantong Plaster，PTTYP)是在水凝膠基礎(chǔ)上加入毛櫻桃提取物制成的貼劑.前期研究已發(fā)現(xiàn)毛櫻桃提取物具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[3].因此，本研究擬在毛櫻桃提取物具有抗炎作用的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)一種療效確切、使用安全的新型抗炎鎮(zhèn)痛貼劑.

1 試驗(yàn)儀器與材料

初黏力測(cè)定儀(AT-730，東莞奧通儀器設(shè)備有限公司)；毛櫻桃炎痛貼(北華大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制)；雙氯芬酸鈉貼(50 mg/50 cm2，蚌埠豐原涂山制藥有限公司)；聚丙烯酸鈉NP-700(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；氮酮(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；卡波姆940(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；丙三醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；蒸餾水(北華大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制)；玻璃器材均為國(guó)產(chǎn).

2 試驗(yàn)方法

2.1 毛櫻桃炎痛貼的制備依據(jù)

按劉建霞[4]貼劑基質(zhì)用量的篩選方法，取處方量的聚丙烯酸鈉NP-700，并加入丙三醇，使之充分混合均勻；取處方量的卡波姆940加入處方量的水，溫水加熱，使其充分溶脹，攪拌均勻；將上述兩者充分?jǐn)嚢杌靹蚝蠹纯傻每瞻谆|(zhì).將空白基質(zhì)均勻涂抹于無(wú)紡紗布上，即可得到空白基質(zhì)貼，后續(xù)試驗(yàn)備用；將復(fù)方藥物溶于10 mL水中，均勻涂布于無(wú)紡紗布上，覆襯物使用較為常見(jiàn)、穩(wěn)定且對(duì)藥物作用沒(méi)有影響的塑料膜，制備毛櫻桃炎痛貼.

2.2 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)的單因素分析

為得到適宜的毛櫻桃炎痛貼，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察卡波姆940 溶液、聚丙烯酸鈉NP-700、丙三醇的用量對(duì)毛櫻桃炎痛貼貼劑質(zhì)量的影響.在不改變聚丙烯酸鈉NP-700、丙三醇的情況下，分別加入 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g的卡波姆940制備成貼劑，對(duì)其進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)得分選出適合的卡波姆940加入量.按照此方法依次對(duì)聚丙烯酸鈉NP-700、丙三醇的用量進(jìn)行優(yōu)化篩選.

2.3 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)制備工藝的優(yōu)選

以丙三醇、卡波姆940和聚丙烯酸鈉NP-700為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)計(jì)了 L9(34)正交試驗(yàn)[5]，探討卡波姆940、聚丙烯酸鈉NP-700、丙三醇的用量對(duì)貼劑質(zhì)量的影響.見(jiàn)表1.

表1 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)制備工藝正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Orthogonal experimental factors for preparation of PTTYP stroma

2.4 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

使用初黏力[6]測(cè)定儀測(cè)定毛櫻桃炎痛貼的初黏力，對(duì)其初黏力、膜殘留度、均勻性、涂布性、皮膚黏力進(jìn)行評(píng)分，總分為50分.由于初黏力對(duì)貼劑質(zhì)量的影響比較大，所以規(guī)定初黏力所占比例為60%，其余各項(xiàng)各占 10%.見(jiàn)表2.

表2 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Evaluation index and scoring standard of PTTYP stroma

2.5 毛櫻桃炎痛貼促透劑最適劑量的優(yōu)選

本試驗(yàn)選擇氮酮作為促透劑，采用Franz透皮擴(kuò)散裝置[6-9]，將制備好的分別含有氮酮0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g毛櫻桃炎痛貼依次貼于離體鼠皮上，裁剪與透皮擴(kuò)散池?cái)U(kuò)散通道直徑一般大小后，黏附在擴(kuò)散池通道，皮膚角質(zhì)層朝外，擴(kuò)散池中加入約4.0 mL的PBS溶液，擴(kuò)散池恒溫水浴夾層內(nèi)循環(huán)水溫為 (32±0.5)℃.將攪拌子放入擴(kuò)散室中，恒速(100 r/min)攪拌，平衡5 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn) 2、4、6、8、10、12 h分別取樣2.0 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量PBS溶液，所取樣品液采用 UV 法測(cè)定毛櫻桃總黃酮(Prunustomentosathumbtotal flavonoids，PTTTF)含量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.009 1X+0.000 2(R2=0.999 2)換算成濃度，并按照下列公式計(jì)算出總黃酮累積透過(guò)量Q(μg/cm2)：

其中：Q為單位時(shí)間累積滲透量；V為接受池體積；Cn為第n次取樣時(shí)接受液的濃度；Ci為第i次取樣時(shí)接受液的濃度；Vi為取樣量.

2.6 毛櫻桃炎痛貼對(duì)小鼠巴豆油致耳腫脹影響

取昆明種雄性小白鼠50只，隨機(jī)分5組，每組10只，分別為模型組、毛櫻桃炎痛貼0.4、0.8、1.6 mg/cm2透皮給藥組、雙氯芬酸鈉貼1.0 mg/cm2透皮給藥組.給藥前小鼠背部脫毛大于1 cm2，分別剪取毛櫻桃炎痛貼0.4、0.8、1.6 mg/cm2和雙氯芬酸鈉貼1.0 mg/cm2各1 cm2，貼于相應(yīng)劑量組小鼠的背部脫毛區(qū)，模型組小鼠背部脫毛區(qū)貼空白貼劑1 cm2，各組1次/d進(jìn)行透皮給藥，連續(xù)貼4 d.最后1次給藥30 min后去除藥貼，在小鼠右耳廓兩面均勻涂抹2%巴豆油溶液25 μL，左耳不抹巴豆油作為空白對(duì)照.4 h后斷髓處死，剪下左右耳片，用6 mm打孔器打下雙側(cè)耳片.然后用電子天平分別稱重，計(jì)算各組腫脹度及腫脹抑制率：

耳腫脹度(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg)，

2.7 毛櫻炎痛貼對(duì)熱板所致小鼠疼痛的影響

將致痛小鼠放在55 ℃的恒溫?zé)岚迳?，分別在0.5、1、1.5、2 h時(shí)記錄痛閾，并計(jì)算痛閾提高百分率，若給藥后超過(guò)60 s無(wú)舔足現(xiàn)象，取出小鼠，痛閾值按60 s記錄[10].痛閾提高百分率=[給藥后痛閾(s)-給藥前痛閾(s)]/給藥前痛閾(s)×100%.

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié) 果

3.1 毛櫻桃炎痛貼基質(zhì)中單因素對(duì)貼劑評(píng)分的影響

3.1.1 聚丙烯酸鈉NP-700對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響

0.75 g聚丙烯酸鈉NP-700對(duì)貼劑的影響總分最高，0.5 g和1 g聚丙烯酸鈉NP-700對(duì)貼劑的影響總分次之.見(jiàn)表3.

表3 聚丙烯酸鈉NP-700對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響Tab.3 Effect of sodium polyacrylate NP-700 on matrix score of patch stroma

3.1.2 丙三醇對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響

配方中加入4 g丙三醇對(duì)貼劑基質(zhì)的影響總分最高，配方中加入3、5 g丙三醇對(duì)貼劑基質(zhì)的影響總分次之.見(jiàn)表4.

表4 丙三醇對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響Tab.4 Effect of glycerol on matrix score of patch stroma

3.1.3 卡波姆940對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響

配方中加入0.1 g卡波姆940對(duì)貼劑的影響總分最高，0.2、0.4 g卡波姆940對(duì)貼劑的影響總分次之.見(jiàn)表5.

表5 卡波姆940對(duì)貼劑基質(zhì)評(píng)分的影響 Tab.5 Effect of carbomer 940 on matrix score of patch stroma

3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

以初黏力和綜合感官總評(píng)分作為考察指標(biāo)，結(jié)果可見(jiàn)：B因素對(duì)毛櫻桃炎痛貼的制備具有顯著的影響，A、C 因素對(duì)結(jié)果也具有一定的影響，各因素的影響程度依次是卡波姆940(B)>聚丙烯酸鈉NP-700(C)>丙三醇(A)，并得到最佳的制備配方A2B1C2，即卡波姆940 0.2 g、聚丙烯酸鈉NP-700 0.5 g、丙三醇3.0 g.見(jiàn)表6.

表6 毛櫻桃炎痛貼制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

3.3 毛櫻桃炎痛貼促透劑氮酮最適劑量篩選結(jié)果

氮酮在0.2 g添加劑量時(shí)毛櫻桃總黃酮透過(guò)量明顯高于其他4組，所以選定0.2 g為促透劑量.見(jiàn)表7.

表7 氮酮對(duì)毛櫻桃總黃酮滲透量的影響Tab.7 Effect of Azone on the permeation of PTTTF

3.4 毛櫻桃炎痛貼對(duì)巴豆油致小鼠耳腫脹的影響

與模型組比較，毛櫻桃炎痛貼0.4 mg/cm2對(duì)小鼠耳腫脹有明顯的抑制作用(P<0.05)，且其抗炎作用具有劑量依賴性.見(jiàn)表8.

表8 毛櫻桃炎痛貼對(duì)小鼠巴豆油耳腫脹的影響Tab.8 Effect of Prunus tomentosa thumb Yantong Plaster on the swelling of croton oil ears in mice

3.5 毛櫻桃炎痛貼對(duì)小鼠熱板法致痛的影響

毛櫻桃炎痛貼各劑量組和模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).毛櫻桃炎痛貼L組、M組用藥前后小鼠的痛閾提高率差異不大，但均比對(duì)照組高，其中高劑量組用藥后痛閾增加明顯，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；毛櫻桃炎痛貼各劑量對(duì)小鼠痛閾的影響隨著劑量的增加而加大，作用與劑量具有一定的相關(guān)性.見(jiàn)表9.

表9 毛櫻桃炎痛貼對(duì)小鼠熱板法致痛的影響Tab.9 Effect of Prunus tomentosa thumb Yantong plaster on pain induced by hot plate method in mice

4 結(jié) 論

炎癥是機(jī)體對(duì)各種傷害因素所產(chǎn)生的防御反應(yīng)，主要表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛等，常伴發(fā)于其他疾病的發(fā)病過(guò)程，以風(fēng)濕和類風(fēng)濕等疾病的炎性反應(yīng)更為突出.

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了毛櫻桃炎痛貼的制備方法，并通過(guò)巴豆油致小鼠耳腫脹試驗(yàn)和熱板法致小鼠疼痛試驗(yàn)觀察毛櫻桃炎痛貼對(duì)炎癥和疼痛的抑制作用.結(jié)果表明：卡波姆940對(duì)炎痛貼有較好的增稠作用，不同含量的卡波姆940制成的貼劑黏度不同，卡波姆940在0.2 g時(shí)炎痛貼質(zhì)量評(píng)分最高；聚丙烯酸鈉NP-700對(duì)基質(zhì)具有較好的增黏作用，聚丙烯酸鈉NP-700 0.5 g時(shí)貼劑的質(zhì)量評(píng)分最高.丙三醇作為保濕劑，用量過(guò)多時(shí)基質(zhì)黏性不夠，貼服性較差，用量過(guò)少時(shí)黏性過(guò)大，不易涂展[11].本研究發(fā)現(xiàn)：選取丙三醇3 g時(shí)，炎痛貼質(zhì)量評(píng)分最高.透皮促進(jìn)劑的種類有很多，促進(jìn)吸收的效果也有強(qiáng)有弱，用量過(guò)多不僅會(huì)達(dá)到飽和，還會(huì)影響巴布劑基質(zhì)性能，太少促透效果差，因此，透皮促進(jìn)劑的選擇應(yīng)遵循用量少、作用強(qiáng)的原則；常用的透皮吸收促進(jìn)劑包括氮酮、油酸、冰片、薄荷醇等.有研究[6-8]證實(shí)：氮酮作為貼劑的促透劑，具有脂溶性高、用量少的優(yōu)點(diǎn)，尤其是與天然植物提取物配伍使用.通過(guò)透皮吸收試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，氮酮含量為0.2 g時(shí)，毛櫻桃總黃酮24 h累積滲透量最多.藥效活性研究結(jié)果表明：毛櫻桃炎痛貼可顯著抑制巴豆油致小鼠耳腫脹，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).同時(shí)，毛櫻桃炎痛貼能夠抑制小鼠熱板所致的疼痛，且與劑量呈正相關(guān)，1.5 h內(nèi)作用明顯，說(shuō)明毛櫻桃炎痛貼具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性.

綜上，毛櫻桃炎痛貼具有較強(qiáng)的抗炎鎮(zhèn)痛作用，安全性高，炎癥患者可以長(zhǎng)期貼敷.因此，毛櫻桃炎痛貼可能成為一種新的抗炎抗風(fēng)濕類天然藥物.