高粱鏈格孢葉斑病菌生物學特性研究

趙艷琴 石凱 張麗娟 張冬梅 于秀英

摘要 ：為明確高粱鏈格孢葉斑病菌Alternaria alternata的生物學特性，本文采用生長速率法研究了不同營養(yǎng)及環(huán)境條件對該病菌生長的影響。試驗結果表明：不同培養(yǎng)基上菌絲生長有明顯差異，其中馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）最適合菌絲生長和孢子產(chǎn)生;不同碳、氮源條件下菌絲的生長有顯著差異，其中最適宜菌絲生長碳源為葡萄糖，氮源是蛋白胨;該病原菌最適宜營養(yǎng)生長的溫度為28℃，pH為7;菌絲的致死溫度為47℃;光照時間對高粱葉斑病菌絲的營養(yǎng)生長沒有影響。

關鍵詞 ：高粱; 鏈格孢葉斑病; 生物學特性; 交鏈格孢

中圖分類號：

S 435.14

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020418

Biological characteristics of the pathogen causing Alternaria leaf spot in sorghum

ZHAO Yanqin*， SHI Kai， ZHANG Lijuan， ZHANG Dongmei， YU Xiuying

（College of Agriculture， Inner Mongolia University for the Nationalities， Tongliao 028000， China）

Abstract

To clarify the biological characteristics of the pathogen causing Alternaria leaf spot in sorghum， the growth rate method was used to study the effects of different nutritional and environmental conditions on the growth of the pathogen.The results showed that the mycelial growth on different culture media was obviously different.PSA （potato sucrose agar） medium was the most suitable for hyphal growth and sporulation.Different carbon and nitrogen sources had significant effect on the growth of the pathogen， among which the most suitable carbon source was glucose， and the most suitable nitrogen source was peptone.The optimum temperature for mycelial growth was 28℃; the optimum pH was seven， and the lethal temperature was 47℃.Illumination time had no effect on the mycelial growth.

Key words

sorghum; Alternaria leaf spot; biological characteristics; Alternaria alternata

高粱在我國是僅次于小麥、水稻、玉米和大麥居世界第五位的作物。作為重要的飼料作物，種植面積較大。病害是生產(chǎn)上影響高粱產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。目前已報道60余種高粱病害[1]，其中15種發(fā)生較普遍。2014年國內(nèi)首次報道江蘇省南通市發(fā)生了由Alternaria sp.引起的高粱鏈格孢葉斑病，但未鑒定到種[2]。2017年內(nèi)蒙古通遼市也報道了該病害發(fā)生，并鑒定病原為A.alternata[3]。作為一種國內(nèi)新報道的病害，尚缺少對該病害的系統(tǒng)研究。

本研究前期經(jīng)組織分離、單孢純化、致病性測定已經(jīng)獲得病原菌，并通過對病原菌的形態(tài)學和分子生物學研究確定該病原菌為無性態(tài)真菌鏈格孢屬交鏈孢A.alternata[4]。因該病害僅見在江蘇南通和內(nèi)蒙古通遼發(fā)生，國內(nèi)外鮮見關于該病害的研究報道。為了對高粱葉斑病原菌進行有效的防治及為抗病育種工作的開展等提供理論依據(jù)，本研究對該病害的生物學特性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：2014年分離自通遼市科爾沁區(qū)內(nèi)蒙古民族大學農(nóng)學院實驗田高粱葉片，經(jīng)組織分離及單孢子純化后獲得菌株GLYK2和GLYK4用于病原菌鑒定，并對菌株GLYK4進行生物學特性的測定，全部菌株由內(nèi)蒙古民族大學植物病理學實驗室4℃低溫保存。

培養(yǎng)基：包括PSA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、查氏（Czapek）固體培養(yǎng)基、WA培養(yǎng)基、理查德（Richard）培養(yǎng)基、高粱葉片培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基[5]。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對高粱葉斑病菌菌絲生長的影響

將菌株于PDA培養(yǎng)基平板上活化后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅。將菌餅分別接種于各種培養(yǎng)基平板中央，置于28℃下黑暗培養(yǎng)6 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理3次重復。

1.2.2 不同碳、氮源對高粱葉斑病菌菌絲生長的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎，將菌餅分別轉(zhuǎn)接于以蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖和乳糖為碳源的查氏固體培養(yǎng)基上，以無蔗糖為對照;另以氯化銨、蛋氨酸、蛋白胨、甘氨酸、氨基乙酸、谷氨酸、硝酸鈉、尿素和牛肉浸膏為不同氮源的查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)供試菌株，以無硝酸鈉為對照[56]。每個處理3次重復，將所有處理置于28℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件對高粱葉斑病菌菌絲生長的影響

將菌餅移至PDA平板上培養(yǎng)，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35℃和40℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)7 d，共8個處理，每處理重復3次;另取接種菌餅的PDA培養(yǎng)平板分別于28℃下持續(xù)光照、持續(xù)黑暗、12 h光暗交替3種條件下培養(yǎng)，每處理3 次重復，培養(yǎng)6 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑[56]。

試管加10 mL無菌水高壓蒸汽滅菌后備用，取菌餅置于其中，每個試管放3個菌餅。分別將試管置于42、43、44、45、46、47、48、49℃的恒溫水浴鍋中，處理10 min后，轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)3 d后觀察病原菌的存活情況。

無菌操作條件下采用1 mol/L 的HCl和1 mol/L NaOH 溶液將滅菌的PDA培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，將菌餅分別接種在不同pH的PDA培養(yǎng)基上，每個處理3次重復，28℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理分析，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗采用SPSS 17.0。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌落生長及產(chǎn)孢的影響

由表1可知，高粱葉斑病菌A.alternata菌株在8種培養(yǎng)基上均能生長，其中在PSA和PDA培養(yǎng)基上的生長速度最快，培養(yǎng)6 d菌落直徑達65.2 mm和64.4 mm;其次為高粱葉培養(yǎng)基和燕麥片培養(yǎng)基，菌落直徑達到58.6 cm和50.7 cm;其他培養(yǎng)基的菌落直徑大小為查氏培養(yǎng)基>理查德培養(yǎng)基>胡蘿卜培養(yǎng)基>水瓊脂（WA）培養(yǎng)基，其中在WA培養(yǎng)基上的生長速度最慢，菌落直徑僅為25.6 mm。不同培養(yǎng)基對高粱葉斑病菌菌株產(chǎn)孢有顯著的影響，其中在理查德培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，達到4.09×106個/mL;其次是PSA培養(yǎng)基3.22×106個/mL，其他依次為查氏培養(yǎng)基、PDA和胡蘿卜培養(yǎng)基;高粱葉、燕麥片和水瓊脂培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量均較低。

菌落在PSA和 PDA培養(yǎng)基上均表現(xiàn)為棕褐色，有輪紋，邊緣光滑整齊，其中在PSA上菌落稍平伏，而在PDA培養(yǎng)基上菌落厚重;在燕麥片培養(yǎng)基和高粱葉培養(yǎng)基上均產(chǎn)生扇形部分，菌落邊緣光滑整齊，有輪紋排列;查氏培養(yǎng)基、理查德培養(yǎng)基、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基和胡蘿卜培養(yǎng)基上菌株的生長明顯受到了抑制，菌落表現(xiàn)為菌絲稀疏，生長受到抑制，其中理查德培養(yǎng)基的菌落邊緣變?yōu)殇忼X狀。

上述結果表明，PSA培養(yǎng)基是既適合菌株菌絲生長又適合孢子產(chǎn)生的培養(yǎng)基;理查德和查氏培養(yǎng)基對菌絲生長和產(chǎn)孢表現(xiàn)均中等;而高粱葉、燕麥片和胡蘿卜培養(yǎng)基對菌株生長沒有表現(xiàn)出特殊的促進作用，反而抑制生長。

2.2 不同碳、氮源對高粱葉斑病菌菌絲生長的影響

由表2可知，高粱葉斑病菌A.alternata可以利用多種碳源。在供試的各種碳源中，最適宜菌絲營養(yǎng)生長的碳源為葡萄糖，其平均菌落直徑達64.9 mm;其次是乳糖、可溶性淀粉、半乳糖和麥芽糖，平均菌落直徑為52.9～56.3 mm;果糖和木糖較差，平均菌落直徑為45.2 mm和44.4 mm，與不加碳源的對照培養(yǎng)基沒有顯著差異，表明這兩種碳源對高粱葉斑病菌菌絲生長完全沒有促進作用;而蔗糖的表現(xiàn)最差，平均菌落直徑為37.8 mm，小于對照的平均菌落直徑，表明蔗糖有抑制菌絲生長的作用。

高粱葉斑病菌A.alternata可以利用多種氮源（表2）。最適宜其菌絲營養(yǎng)生長的氮源為蛋白胨，平均菌落直徑為66.4 mm，其次為氨基乙酸，菌落直徑62.4 mm，表明有機態(tài)氮是高粱葉斑病菌比較適合的氮源;再次為NaNO 3和蛋氨酸，其平均菌落直徑分別為54.5 mm和53.7 mm，表明硝態(tài)氮是較好促進高粱葉斑病菌生長的氮源;牛肉浸膏、NH 4Cl和無氮源的對照培養(yǎng)基之間沒有顯著差異，表明銨態(tài)氮和牛肉浸膏都沒有促進高粱葉斑病菌菌絲生長的作用;而尿素和（NH 4） 2SO 4的平均菌落直徑極顯著低于對照，表明其對高粱葉斑病菌菌絲生長有明顯的抑制作用。

由圖1可知，以蔗糖為碳源的菌落為黃褐色，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達;以乳糖為碳源的菌落為深褐色，菌落邊緣光滑，菌絲平伏;以果糖為碳源的菌落中央白色，其他部位為乳白色，絨毛狀，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達。葡萄糖為碳源的菌落灰白色，菌落中央氣生菌絲濃密，向周圍擴展逐漸輕薄，菌落呈輪紋狀，邊緣整齊。在麥芽糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌落形態(tài)相似，為土黃色，中央氣生菌絲略高，菌落呈輪紋狀。半乳糖為碳源除菌落中央有很少的褐色外，其余部分為乳白色。木糖為碳源的培養(yǎng)基中菌落為淡黃色，菌絲濃密，邊緣呈鋸齒狀。查氏培養(yǎng)基中無蔗糖對菌落的形態(tài)影響不大，菌落為黃褐色，邊緣整齊。

由圖1可知，以NH 4Cl為氮源的培養(yǎng)基上菌落為灰色，中央為褐色，后向外依次形成白色、灰色及白色的輪紋。蛋氨酸為氮源的培養(yǎng)基菌落為淺灰色，與NH 4Cl為氮源的菌落形態(tài)類似。以蛋白胨為氮源的菌落顏色較深，為深褐色，菌落中央氣生菌絲濃密，其他部分菌絲平伏，邊緣整齊。氨基乙酸為氮源的培養(yǎng)基上菌落為土黃色，菌絲質(zhì)地厚重，濃密，邊緣整齊。在以 （NH 4） 2SO 4 為氮源的培養(yǎng)基上菌落褐色，略帶輪紋。在甘氨酸為氮源的培養(yǎng)基上菌落為淡黃色，菌絲濃密，邊緣整齊。在以NaNO 3 為氮源的培養(yǎng)基上菌落深褐色，無輪紋，菌絲平伏，邊緣不整齊。在氮源為尿素的培養(yǎng)基上菌落深褐色，邊緣光滑。牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落顏色為深灰色，有清晰的輪紋，菌落邊緣光滑整齊。無NaNO 3 的對照培養(yǎng)基上菌落生長明顯受到影響，菌絲顏色為黑色，質(zhì)地輕薄，稀疏。

2.3 溫度、光照及pH對高粱葉斑病菌菌絲生長的影響

圖2顯示，溫度過高與過低均不利于高粱葉斑病菌菌絲生長。在5～35℃范圍內(nèi)，菌絲可以生長，所有溫度處理間菌落直徑均存在極顯著差異。最適生長溫度為28℃，平均菌落直徑達到68.7 mm，其次是25℃，菌落直徑達到62.5 mm;在20℃和30℃下生長明顯變緩慢，平均菌落直徑為53.8 mm和59.9 mm;5℃、10℃和15℃等低溫明顯抑制菌落的生長，而35℃和40℃同樣對菌絲的生長不利。進一步測量菌絲的致死溫度表明：高粱葉斑病菌47℃處理10 min即可死亡。

不同光照條件下高粱葉斑病菌菌株GLYK4的菌落生長沒有顯著差異，不同光照條件下培養(yǎng)3 d，全光照模式下菌落直徑為43.50 mm，光暗交替模式下為44.13 mm，全黑暗模式下為44.73 mm，3種光照模式間菌落直徑不存在顯著差異;而培養(yǎng)5 d全光照模式下的菌落直徑為73.83 mm，光暗交替模式下為72.55 mm，全黑暗模式下為72.75 mm，3種光照模式間菌落直徑依然不存在顯著差異。光照模式對菌落形態(tài)的影響也沒有明顯差異，均表現(xiàn)為菌落正面中央灰綠色，有白色氣生菌絲，邊緣白色，且光滑整齊，菌落背面中央黑綠色，邊緣白色，光滑。

高粱葉斑病菌在pH為3～11時均能生長（圖3），pH 7時生長得最好，培養(yǎng)7 d后平均菌落直徑為50.6 mm;其次是pH 6、8和9，三者沒有顯著差異，平均菌落直徑分別為45.7、43.4 mm和44.0 mm，顯著高于pH 3～5和pH 10～12時。這表明中性、偏酸或偏堿的環(huán)境下都適合高粱葉斑病菌生長，而pH3～5的過酸性條件明顯抑制其生長，菌落直徑僅7.3～26.2 mm;而pH 10～12的過堿性條件對菌絲的生長也有明顯的抑制作用。

3 結論與討論

高粱鏈格孢葉斑病菌對單糖、雙糖和多糖等形式的碳源及有機氮、無機氮均可利用，最適營養(yǎng)生長的碳源為葡萄糖，最適氮源為蛋白胨，銨態(tài)氮不利于病原菌的營養(yǎng)生長，這個結論與王媛媛等對玉米鏈格孢A.alternata[7]的研究結論一致。本文結果顯示高粱鏈格孢葉斑病菌最適生長溫度為28℃，溫度過高會抑制生長，達到40℃，菌絲停止生長，47℃即可致死。張定法等報道對玉米鏈格孢葉斑病菌的致死溫度是48℃[8]，本文結論與其基本一致。而王媛媛等報道玉米鏈格孢菌最適溫度為30℃，在45℃下依然可以形成菌落，52℃下才致死。光照對高粱葉斑病菌的生長沒有明顯影響，這與王媛媛等對玉米鏈格孢菌[7]的研究一致。而王宏等對梨樹黑斑病菌A.alternata [9]的研究認為光暗交替有利于A.alternata的營養(yǎng)生長。pH的研究表明高粱鏈格孢葉斑病菌中性條件下生長最好，在弱酸弱堿的環(huán)境下也能很好地生長，這與王媛媛報道的玉米鏈格孢喜歡中性偏堿的環(huán)境下生長不同。這些不同究其原因可能是由于病原菌盡管在種上一致，但依然存在明顯的生物學上的差異。

本研究曾嘗試對高粱鏈格孢葉斑病菌產(chǎn)孢情況進行測定，但試驗菌株變異快，菌落易形成扇形，不同菌株間產(chǎn)孢能力差異大，且產(chǎn)孢測定3次重復間試驗誤差過大，不能進行顯著性分析。

本文對高粱鏈格孢葉斑病菌的生物學特性進行研究，明確了該病菌的營養(yǎng)需求與生長環(huán)境條件的關系，為了解高粱鏈格孢葉斑病菌的發(fā)生提供了依據(jù)，對該病害的防治具有指導意義。

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（責任編輯：田 喆）