UV-B預(yù)處理對擬南芥uvr8-2突變體響應(yīng)干旱脅迫的影響

向 花，呂桂珍，李韶山

(生態(tài)與環(huán)境科學(xué)廣東省普通高校重點實驗室∥華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

由于植物固著生長的特性，植物的生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭受多重環(huán)境逆境的影響. UV-B輻射通常伴隨著高強度的光合有效輻射(PAR)，以及在一些地區(qū)還存在高溫和干旱等環(huán)境因素，導(dǎo)致植物對UV-B輻射的響應(yīng)可能與其它環(huán)境因素相互作用[1]. UV-B和干旱均能引起ROS、H2O2、NO的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)ABA、乙烯、JA和SA的合成. 這些分子可能激活交叉反應(yīng)中的防御機制，提高葉片的含水量，積累吸收UV-B的類黃酮、合成多胺、LEA蛋白和脫水蛋白以及上調(diào)酶和非酶抗氧化系統(tǒng)[2-4]. 在多種植物中發(fā)現(xiàn)UV-B能對植物的干旱響應(yīng)產(chǎn)生影響. DRILIAS等[5]發(fā)現(xiàn)UV-B處理使夾竹桃葉片角質(zhì)層厚度增加，減少了其在干燥夏季的表皮蒸騰作用. SCHMIDT等[6]發(fā)現(xiàn)UV-B誘導(dǎo)的葉片含水量的提高可能與滲透物質(zhì)的產(chǎn)生和脫水蛋白的積累有關(guān)，而不是氣孔關(guān)閉. HE等[7]發(fā)現(xiàn)UV-B預(yù)處理能增加小麥的抗旱能力，且干旱預(yù)處理也能增加小麥對UV-B的耐受性，表明干旱和UV-B之間存在交叉作用(Crosstalk of Stress Tolerance).

環(huán)境中UV-B(280～315 nm)輻射已經(jīng)不僅是一種脅迫因子，更多的是作為一種信號參與植物生長、發(fā)育和代謝等各個方面. 植物暴露在UV-B輻射下會表現(xiàn)出葉片增厚、葉片數(shù)量減少、子葉卷曲、下胚軸伸長的抑制等[8]. RIZZINI等[9]發(fā)現(xiàn)UVR8蛋白是UV-B信號的光受體. UVR8蛋白由2個不同的結(jié)構(gòu)域組成，包括由RCC1重復(fù)結(jié)構(gòu)形成的一個7環(huán)的β螺旋核心結(jié)構(gòu)域和C末端由27個氨基酸組成的C27結(jié)構(gòu)域[10]. UVR8感知到UV-B信號后，迅速地由二聚體解聚為單體并進入細胞核[11]，通過C端的C27結(jié)構(gòu)域與COP1(Constitutively Photomorphogenic 1)相互作用[12]，并調(diào)控下游HY5(Elongated Hypocotyl 5)、HYH(HY5-Homolog)以及一系列光形態(tài)建成基因的表達[13]，從而啟動UV-B信號的轉(zhuǎn)導(dǎo). POULSON等[14]發(fā)現(xiàn)：在擬南芥中，UV-B誘導(dǎo)的抗旱性在生理水平上與保水性的提高，脯氨酸的含量升高和氣孔導(dǎo)度降低有關(guān)，UVR8(UV Resistance Locus 8)為擬南芥感知UV-B信號的光受體，其在介導(dǎo)UV-B和干旱脅迫中是否發(fā)揮作用仍然未知.

uvr8-2是利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯誘變產(chǎn)生的突變體，其蛋白的C端缺乏C27結(jié)構(gòu)域，不能與COP1發(fā)生相互作用[12].uvr8-2突變體缺乏UVR8介導(dǎo)的UV-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有助于認識UV-B誘導(dǎo)的擬南芥干旱適應(yīng)性與UVR8介導(dǎo)的UV-B信號通路的關(guān)系. 本實驗室的前期研究證實STO/BBX24是細胞內(nèi)UV-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負調(diào)控因子[15]. 本研究利用uvr8-2突變體，研究其與野生型Ler在UV-B預(yù)處理后干旱脅迫下的表型、生理響應(yīng)和相關(guān)基因表達量等方面是否存在差異，為認識UVR8在UV-B誘導(dǎo)的干旱適應(yīng)性中是否發(fā)揮作用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料與培養(yǎng)

植物材料為擬南芥(Arabidopsisthaliana)，野生型材料為Landsbergerecta(Ler)生態(tài)型，以及以Ler為背景的uvr8-2(愛爾蘭科克大學(xué)Marcel Jansen惠贈). 種子于4 ℃黑暗春化處理3 d，用10%次氯酸鈉表面消毒，播種于含有1%蔗糖、0.8%瓊脂的1/2MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)基(pH 5.8)上，并置于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗、PAR為60～80 μmol/(m2·s)的白光(Philips TLD30 W/865燈管, 由International Light 可見光光度計測量)下生長1周后，將擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至土壤基質(zhì)為V(營養(yǎng)土)∶V(珍珠巖)=1∶1、孔徑為60 mm×60 mm、穴深60 mm的育苗盤中繼續(xù)培養(yǎng).

1.2 UV-B和干旱處理

光源來自Phlilips TL20 W/01 RS窄波段UV-B燈管，經(jīng)醋酸纖維素膜(濾除292 nm以下波段)過濾后得到UV-B光源，實驗設(shè)定的UV-B輻射強度為0.3 W/m2(由International Light UV-B 光度計測定). 經(jīng)聚酯薄膜(濾除315nm以下波段)過濾后無UV-B光源，+/-UV-B下均附加10 μmol/(m2·s)光合輻射有效劑量的微弱白光.

取在土壤基質(zhì)中生長2周后的擬南芥苗Ler和uvr8-2進行+/-UV-B處理1周后，將其置于白光下培養(yǎng)記為第1天，并各自分為正常澆水和干旱，實驗共設(shè)4組：對照組、UV-B處理組、干旱組和UV-B+干旱組.

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 相對含水量測定 待培養(yǎng)處理7 d后，稱取植株相同部位的蓮座葉0.1 g，采用復(fù)水法[16]測定相對含水量，計算公式為：相對含水量(%)=(Fw-Dw)/(Rw-Dw)，其中Fw、Dw、Rw分別為鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和復(fù)水質(zhì)量.

1.3.2 抗氧化酶系統(tǒng)測定 待培養(yǎng)處理7 d后，稱取植株相同部位的蓮座葉0.1 g，加入1 mL酶提取液(50 mmol/L PBS，0.1 mol/L EDTA，0.1% Triton X-100，2% PVP)研磨，離心后取上清液轉(zhuǎn)移至離心管中并冰浴，即為待測酶液. 參考李合生[17]的方法測超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈創(chuàng)木酚法[18]測過氧化物酶(POD)活性，紫外分光光度法[19]測過氧化氫酶(CAT)活性，酶活性均以每克鮮質(zhì)量酶單位表示.

1.3.3 細胞膜滲透率測定 待培養(yǎng)處理7 d后，稱取植株相同部位的蓮座葉0.05 g，細胞膜滲透率的測定采用相對電導(dǎo)率法[20].

1.3.4 激素含量測定 在干旱處理的第7、10、13天取樣，稱取干旱組和UV-B+干旱組的植株蓮座葉各0.1 g，在1 mL預(yù)冷的磷酸緩沖液中研磨，轉(zhuǎn)入2 mL離心管，4 ℃下8 000 r/min離心. 吸取上清液用Elisa試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)測定脫落酸(Abscisic Acid, ABA)、茉莉酸(Jasmonic Acid, JA)和水楊酸(Salicylic Acid, SA)3種激素的質(zhì)量分數(shù)(以鮮質(zhì)量計)，其具體測定方法參考試劑盒說明書. 試劑盒均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)，顏色的深淺和樣品中的激素呈正相關(guān). 用酶標(biāo)儀測450 nm波長下的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的激素質(zhì)量分數(shù).

1.3.5 基因的表達量測定 取第7天干旱組和UV-B+干旱組植株相同部位的蓮座葉0.1 g，液氮研磨后用RNAiso Plus (Takara, Japan) 進行RNA的提取，超微量紫外可見光分光光度計(Nanodrop-2000, Beckman, USA )檢測RNA的質(zhì)量，使用PrimeScriptTMRT Regent Kit with gDNA Eraser (Takara, Japan) 進行基因組DNA的去除和cDNA的合成，使用TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara, Japan)進行qPCR，并在QuantStudioTM6 Flex Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA)上進行實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)的采集. 采用△△Ct法，以Actin2作為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達. 利用Primer Premier 5設(shè)計目的基因引物，并由生工生物公司合成，其序列見表1.

表1 實時熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Primers for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

計算各處理組3個重復(fù)樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤，用繪圖軟件Origin 2017作圖，采用SPSS 19進行顯著分析，實驗數(shù)據(jù)均采用單因素方差(ANOVA)分析，采用Duncan法進行多重比較，圖中相同字母表示組間無顯著差異，不同字母表示組間差異顯著(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株表型和相對含水量的影響

為保持土壤水分一致，將Ler和uvr8-2分列種植在同一穴盤中，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對照組和干旱組，即未經(jīng)UV-B預(yù)處理的Ler和uvr8-2植株的生長狀態(tài)相似，均為嫩綠色；UV-B和UV-B+干旱組，即UV-B預(yù)處理的uvr8-2植株呈現(xiàn)黃綠色；干旱7 d時，干旱組Ler和uvr8-2植株的葉片出現(xiàn)輕微的萎焉現(xiàn)象，但UV-B+干旱組無此現(xiàn)象；干旱14 d時，干旱組Ler和uvr8-2植株的葉片萎焉現(xiàn)象較為嚴重，植株組織失水而干枯，莖桿倒伏，但UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株僅出現(xiàn)葉片卷曲和輕微萎焉現(xiàn)象；待復(fù)水5 d后，植株重新吸收水分，干旱組Ler和uvr8-2植株已無法恢復(fù)生長，但UV-B+干旱組植株Ler和uvr8-2的莖桿挺直，正常生長(圖1)，表明UV-B預(yù)處理能夠提高擬南芥Ler和uvr8-2植株的干旱適應(yīng)性.

奇數(shù)列的植株(1，3，5，7，9，11，13，15)為野生型Ler，偶數(shù)列的植株(2，4，6，8，10，12，14，16)為uvr8-2突變體

對照組和UV-B組的Ler和uvr8-2植株的相對含水量無顯著性差異(圖2)；干旱組和UV-B+干旱組葉片的相對含水量顯著低于對照組和UV-B組；與干旱組相比，UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株的相對含水量分別提高了18.49%、8.97%，表明UV-B預(yù)處理可減緩干旱脅迫下擬南芥Ler和uvr8-2植株葉片的水分散失. UV-B+干旱組擬南芥Ler和uvr8-2植株葉片的相對含水量有顯著差異，擬南芥uvr8-2植株比Ler植株相對含水量低12.71%.

圖2 UV-B預(yù)處理對擬南芥葉片相對含水量的影響

2.2 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)是植物逆境條件下保護細胞的重要酶類. 測定抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn)(圖3)：UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株的SOD、POD、CAT活性均顯著高于干旱組，提高了26.03%～38.98%，表明UV-B預(yù)處理能增強擬南芥Ler和uvr8-2植株的抗氧化酶活性來應(yīng)對干旱脅迫造成的氧化損傷. 而UV-B+干旱組擬南芥Ler與uvr8-2植株的SOD、POD、CAT活性有顯著差異，UV-B+干旱組擬南芥uvr8-2的SOD活性比Ler植株低26.76%，但POD、CAT活性比Ler植株分別高1.33倍和23.84%.

2.3 UV-B預(yù)處理對擬南芥葉片細胞膜滲透率的影響

相對電導(dǎo)率表示電解質(zhì)的滲漏量，體現(xiàn)細胞膜受損程度. 測定相對電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)：干旱脅迫處理顯著增加了Ler和uvr8-2植株的相對電導(dǎo)率，其中干旱組的相對電導(dǎo)率最高，分別為34.73%和46.93%. 與干旱組相比，UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株的相對電導(dǎo)率顯著降低，只有干旱組的45.92%、49.00%，表明UV-B預(yù)處理能降低干旱對擬南芥Ler和uvr8-2植株葉片造成的傷害. UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株的相對電導(dǎo)率存在顯著差異，uvr8-2植株的相對電導(dǎo)率比Ler高30.65%(圖4).

圖3 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株抗氧化酶活性的影響

圖4 UV-B預(yù)處理對擬南芥葉片細胞膜滲透率的影響

2.4 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株激素質(zhì)量分數(shù)的影響

植物抵御干旱脅迫涉及多種激素共同作用，因此測定了干旱組和UV-B+干旱組擬南芥Ler和uvr8-2植株中ABA、JA和SA激素的質(zhì)量分數(shù)(圖5). 隨著干旱時間的延長，干旱組和UV-B+干旱組擬南芥Ler和uvr8-2植株中w(ABA)、w(JA)和w(SA)均呈逐漸增加的趨勢；且對同種植株，UV-B+干旱組的w(ABA)、w(JA)和w(SA)均顯著高于干旱組，Ler和uvr8-2植株中w(ABA)的增幅分別為114.96%～127.27%、35.40%～86.91%；w(JA)的增幅分別為60.64%～77.82%、51.48%～90.83%；w(SA)的增幅分別為41.81%～58.94%、33.59%～46.83%，表明UV-B預(yù)處理能增強干旱脅迫下擬南芥Ler和uvr8-2植株中w(ABA)、w(JA)和w(SA)，有助于更好地應(yīng)對干旱脅迫.

UV-B+干旱組Ler與uvr8-2植株的w(ABA)、w(JA)和w(SA)均有顯著差異，uvr8-2植株的w(ABA)比Ler降低19.02%～21.81%；干旱脅迫13 d時，uvr8-2植株的w(JA)比Ler高22.34%；干旱脅迫7 d時，uvr8-2植株的w(SA)比Ler低8.13%(圖5).

圖5 UV-B預(yù)處理對擬南芥植物激素質(zhì)量分數(shù)的影響

2.5 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株抗氧化酶活性基因表達量的影響

檢測干旱組和UV-B+干旱組植株的抗氧化酶活性基因POD和CAT的表達量發(fā)現(xiàn)(圖6):UV-B+干旱組擬南芥Ler和uvr8-2植株的POD和CAT表達量均顯著高于干旱組，UV-B+干旱組Ler和uvr8-2植株的POD表達量是干旱組的1.76、5.55倍，其CAT表達量分別是干旱組的1.41、2.02倍；而UV-B+干旱組uvr8-2植株的POD表達量是Ler植株的1.73倍，表明干旱脅迫下，UV-B預(yù)處理能誘導(dǎo)擬南芥抗氧化酶基因POD、CAT的表達，增強酶活性，從而提高植株體內(nèi)活性氧的清除能力.

圖6 UV-B預(yù)處理對擬南芥植株抗氧化酶基因表達量的影響

3 討論

隨著全球氣候變暖，由干旱造成的損失日益加劇. 干旱使植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響植物的生理生化功能，進而影響生長發(fā)育. 因此探索如何提高植株的耐旱性具有重要的應(yīng)用價值. 提高植物耐旱性的方法，如接種叢枝菌根真菌(AMF)能增強耐旱性[21]，噴施黃腐酸(HA)能促進小麥葉片持水能力而增強耐旱性[22]，異源表達花生基因AhGLK1(ArachishypogaealL. Golden2-like 1)能提高擬南芥glklglk2突變體的抗旱性[23].

原先普遍認為UV-B是一種脅迫因子，UV-B下小麥的綠葉數(shù)目持續(xù)減少，生物量下降[24]，也會造成植物株高下降，節(jié)間縮短[25]. 越來越多的研究表明UV-B對植物的生長發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，如UV-B使雜草葉片蠟質(zhì)大幅度增加，導(dǎo)致雜草對除草劑的抗性增強[26]. 每天6 kJ/m2UV-B處理的黃杉幼苗更能抗旱，因為其具有較低的蒸騰失水率，能維持更好的水分狀況[27]. 與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)UV-B預(yù)處理減輕了干旱引發(fā)的葉片萎焉卷曲現(xiàn)象，減緩了干旱脅迫下Ler植株葉片的水分散失，表明UV-B預(yù)處理能增強擬南芥Ler植株對干旱的適應(yīng)性.

UVR8是目前已知的感知UV-B信號的唯一受體，利用UV-B光受體uvr8-2突變體，研究uvr8-2植株在UV-B預(yù)處理下的干旱響應(yīng)，有助于認識擬南芥中UV-B誘導(dǎo)的干旱適應(yīng)性與UVR8介導(dǎo)的UV-B信號通路的關(guān)系. 激素作為植物生長的調(diào)節(jié)劑，能參與植物對逆境的響應(yīng)與適應(yīng)過程. 本研究結(jié)果表明：干旱脅迫下，UV-B預(yù)處理均能增加Ler和uvr8-2植株的ABA、JA、SA質(zhì)量分數(shù)，這與VANHAELEWYN等[28]發(fā)現(xiàn)UV-B增強環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的防御激素的效應(yīng)可獨立于UVR8的研究結(jié)果一致. 在植物抵御干旱脅迫過程中，涉及多種激素共同作用. 李長寧[29]、劉杰等[30]研究表明ABA和SA能提高植株的抗氧化酶活性，提高清除活性氧的效率；KIM等[31]發(fā)現(xiàn)擬南芥能通過控制糖酵解轉(zhuǎn)化為乙酸合成途徑開關(guān)，調(diào)控下游JA信號通路，賦予植物干旱能力；SA處理能降低紫御谷葉片的相對電導(dǎo)率[32]；在UV-B處理的大麥幼苗中，增加葉片中的SA水平可以阻止在施加UV-B后缺水條件下葉片含水量的降低[33]. 由此表明：擬南芥中UV-B介導(dǎo)的干旱適應(yīng)性中ABA、JA、SA發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其引起抗氧化酶SOD、POD、CAT活性升高，抗氧化酶基因CAT和POD表達量也顯著增加，活性氧清除能力提高，有助于減輕干旱脅迫下植物體內(nèi)活性氧分子積累造成的細胞損傷，從而緩解干旱脅迫下擬南芥葉片萎焉、相對含水量下降等現(xiàn)象.

UV-B預(yù)處理均能提高擬南芥Ler和uvr8-2植株的干旱適應(yīng)性，推測此過程中uvr8-2植株存在一條不依賴于UVR8的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑. 在干旱脅迫下，UV-B預(yù)處理的Ler和uvr8-2植株的響應(yīng)有不同之處. UV-B+干旱組uvr8-2植株的相對含水量顯著低于Ler，細胞膜滲透率顯著高于Ler，表明UV-B預(yù)處理后擬南芥Ler可能比uvr8-2植株更能適應(yīng)干旱. UV-B+干旱組uvr8-2植株的ABA質(zhì)量分數(shù)顯著低于Ler，JA質(zhì)量分數(shù)顯著高于Ler，表明在UV-B預(yù)處理提高Ler和uvr8-2植株的干旱適應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的激素不同.

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明：UV-B預(yù)處理既能誘導(dǎo)擬南芥野生型Ler對干旱的適應(yīng)性，也能誘導(dǎo)uvr8-2突變體植株的干旱適應(yīng)性. UV-B預(yù)處理通過增加植株體內(nèi)ABA、JA和SA植物激素的質(zhì)量分數(shù)，調(diào)控抗氧化酶基因CAT、POD表達和增強抗氧化酶活性，從而緩解干旱脅迫下擬南芥葉片萎焉、相對含水量下降等現(xiàn)象. 本研究揭示了UV-B預(yù)處理誘導(dǎo)擬南芥的干旱適應(yīng)性存在不依賴于UVR8的通路，為深入研究UV-B提高擬南芥干旱適應(yīng)性的分子機制提供依據(jù).