山藥低聚糖制備分離及對五種益生菌的增殖作用

丁伯樂，蔡為榮，聞志瑩，岳丹偉，朱櫻，李晶晶

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖，241000)

益生菌具有促進(jìn)機體吸收營養(yǎng)物質(zhì)[1]，提高機體免疫力[2]，提高機體抗氧化水平[3]，抑制腸道炎癥[4]等功能，對人體健康具有重要作用。有研究表明，功能性低聚糖具有良好的增殖作用[5-7]，同時具有改善便秘[8]、防腹瀉[9]、降血糖[10]、防腫瘤[11]等多種生理活性。

山藥低聚糖(yam oligosaccharide)是山藥中重要的活性物質(zhì)之一，由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡萄糖醛酸[12]組成，具有良好的增殖作用[13]和抗氧化活性[12]。同時，有研究指出不同分子質(zhì)量的低聚糖會對雙歧桿菌的生長產(chǎn)生影響[14]。對于不同分子質(zhì)量的山藥低聚糖是否會影響益生菌生長的研究尚未見報道，因此，本文通過分離純化山藥低聚糖，利用山藥低聚糖取代葡萄糖為碳源，探究其不同組分對嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)，兩歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)，青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)，BB-12雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalsssp.lactis)以及羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri138-1)5種益生菌的體外增殖作用。同時進(jìn)一步將山藥低聚糖分離純化出3個組分，進(jìn)而研究不同組分山藥低聚糖對不同益生菌的增殖作用，期望為山藥低聚糖的進(jìn)一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、培養(yǎng)基

山藥購于當(dāng)?shù)厥袌?，產(chǎn)地安徽，品種為淮山藥，新鮮度與成熟度良好。嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌CCFM16，青春雙歧桿菌CCFM16以及羅伊氏乳桿菌138-1 CCFM8631，江南大學(xué)微生物實驗室；雙歧桿菌BB-12，科漢森(中國)有限公司。低聚木糖,浙江一諾生物科技有限公司。參照劉露等[13]的方案配置，得到乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

YQX-2厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗器械制造有限公司；JK-JH01超凈臺，安徽杰克歐德實驗室設(shè)備有限公司；IMark酶標(biāo)儀，美國伯樂有限公司；JY-1002電子天平，上海良平天平廠；TY10超純水機，上海精密儀器儀表有限公司；日立S-4800掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山藥低聚糖制備、還原糖及分子質(zhì)量測定

工藝流程如下:

鮮山藥→切片→50 ℃烘10～12 h→粉碎，過120 目篩→樣品(水分6.23%)稱質(zhì)量→超聲波輔助提取→抽濾濃縮→聚酰胺脫蛋白→醇沉→上清液濃縮→冷凍干燥→活性炭色譜柱→LH-20凝膠色譜柱→不同組分低聚糖提取物

山藥低聚糖的初步純化采用加入料液比為1∶4(g∶mL)的聚酰胺，室溫?fù)u床振蕩4 h，進(jìn)行脫蛋白處理，抽濾，加3倍90%(體積分?jǐn)?shù))乙醇醇沉，除去多糖得到初步純化的山藥低聚糖。利用活性炭色譜柱[m(活性炭)∶m(硅藻土)=1∶1],色譜柱規(guī)格2.6 cm×40 cm，上樣量為10 mL，每隔5 min收集一管，每管5 mL，用體積分?jǐn)?shù)為15%，30%，45%的乙醇進(jìn)行梯度洗脫。利用LH-20凝膠色譜柱對初分的不同組分山藥低聚糖分別進(jìn)行再次純化,色譜柱規(guī)格1.6 cm×80 cm，上樣量20 mg/mL，每管5 mL，每隔10 min收集一管。

參照賀蘋蘋[5]的方法，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.404 53x+0.002 45(R2=0.999 6);其中x為葡萄糖濃度，y為吸光值。

樣品的測定：樣品溶液按照賀蘋蘋[5]的方法進(jìn)行處理，于490 nm處測定吸光度，測定時使樣品吸光值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的低聚糖濃度。

根據(jù)原超[15]的低聚糖純度計算公式得到粗多糖、粗低聚糖純度計算如公式(1)所示：

(1)

式中：P，粗多糖或粗低聚糖純度，%；C1，粗多糖或粗低聚糖溶液中總糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N1，測定粗多糖或粗低聚糖中總糖時樣品的稀釋倍數(shù)；C2，粗多糖或粗低聚糖溶液中還原糖質(zhì)量濃度，mg/mL；N2，測定粗多糖和粗低聚糖中還原糖時樣品的稀釋倍數(shù)；V，溶液體積，mL；m1，粗多糖、粗低聚糖質(zhì)量(干基計)，mg。

對3組分山藥低聚糖進(jìn)行分子質(zhì)量的測定，色譜條件：色譜柱UItrahydrogelMLinear 300 mm×7.8 mm×2，流動相0.1 mol/L NaNO3，流速0.9 mL/min，柱溫45 ℃，樣品制備：將樣品溶解于流動相中，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣。分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量分別為135 350、36 800、9 750、2 700、180。

1.3.2 山藥低聚糖的掃描電鏡分析

取少量山藥低聚糖黏附于樣品臺上，置于真空噴鍍儀內(nèi)鍍上導(dǎo)電層，采用S-4800掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.3 益生菌菌種增殖活化

從凍庫管中吸取青春雙歧桿菌，嬰兒雙歧桿菌，兩歧雙歧桿菌，BB-12乳雙歧桿菌以及羅伊氏乳桿菌各400 μL,加入到活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，將活化培養(yǎng)基中的菌種轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，活化3次。

1.3.4 山藥低聚糖對益生菌生長曲線的影響

以山藥低聚糖替代葡萄糖為唯一碳源，以無糖，葡萄糖，低聚木糖作為對照，分別加入到青春雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、BB-12乳雙歧桿菌以及羅伊氏乳桿菌5種益生菌中，每隔6 h從試管中吸取200 μL發(fā)酵液，利用酶標(biāo)儀測定OD600值。利用Origin 8.0繪制曲線，比較不同碳源培養(yǎng)基隨著時間的變化對益生菌生長情況的影響。

1.3.5 不同組分山藥低聚糖對益生菌生長曲線的影響

向培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的山藥低聚糖，替代葡萄糖為唯一碳源，通過測定益生菌的OD600值，得到最佳山藥低聚糖加入量。將3種組分不同的山藥低聚糖按照最佳加入量配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)上述實驗結(jié)果較好的益生菌，每隔6 h從試管中吸取200 μL發(fā)酵液，利用酶標(biāo)儀測定OD600值。利用Origin 8.0繪制曲線，比較不同組分山藥低聚糖為碳源的培養(yǎng)基隨著時間變化對益生菌生長情況的影響。

1.3.6 統(tǒng)計分析

運用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異，并通過GraphPad Prism 5 進(jìn)行作圖。綜合評價不同組分山藥低聚糖對不同益生菌的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 山藥低聚糖的分離純化

本實驗中粗山藥低聚糖的得率為8.15%，高于周麗等[16]用微波法的得率6.31%，低于CHEN等[12]用H2O2水解制備的得率11.89%，但本實驗相較于H2O2水解法具有無污染、易控制、成本低等特點。如圖1所示，按1.3.1方法，在85～125管得到第1個峰，收集餾分，為餾分1，測得純度為78.15%，在145～155管得到第2個峰，收集餾分，為餾分2，測得純度為80.52%，在210～220管得到第3個峰，收集餾分，為餾分3，測得純度為79.23%。

圖1 山藥低聚糖活性炭層析柱線性梯度洗脫曲線Fig.1 Elution profile of yam oligosaccharides on activated carbon column

葡聚糖凝膠LH-20對于分離純化中等大小的生物分子具有良好的作用，劉聰?shù)萚17]曾用葡聚糖凝膠LH-20對棉籽低聚糖進(jìn)行了分離純化，取得了較好的結(jié)果。本實驗樣品通過凝膠柱的再次分離純化，得率為5.86%。如圖2所示，按照1.3.1方法，將餾分1過凝膠柱，得到餾分1吸光度，如圖2-a，收集10～25管的餾分，作為組分1(Fr1)，測得純度為93.24%，同理，如圖2-b、圖2-c，收集10～30管以及10～25管的餾分，分別作為組分2(Fr2)和組分3(Fr3)，測得純度分為93.17%和92.35%。

a-餾分1；b-餾分2；c-餾分3圖2 山藥低聚糖LH20凝膠色譜柱線性梯度洗脫曲線Fig.2 Elution profile of yam oligosaccharides on LH20 gel column

2.2 三種不同組分分子質(zhì)量的測定

如圖3所示，測得Fr1的數(shù)均分子質(zhì)量為0.74 kDa，F(xiàn)r2的數(shù)均分子質(zhì)量為0.95 kDa，F(xiàn)r3的數(shù)均分子質(zhì)量為1.25 kDa。

a-Fr1;b-Fr2;c-Fr3圖3 三種山藥低聚糖不同組分分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution of different components of three yam oligosaccharides

表1 高效凝膠色譜法測得各組分的分子質(zhì)量分布結(jié)果Table 1 Molecular weight distribution of each component measured by high performance gel chromatography

2.3 山藥低聚糖掃描電鏡結(jié)果分析

調(diào)節(jié)加速電壓 5 kV，放大 30～80 000 倍，用隨機工作站進(jìn)行拍攝，觀察低聚糖表面的形態(tài)。如圖4所示，觀察發(fā)現(xiàn)35、4 000、11 000以及35 000倍下的山藥低聚糖均呈不規(guī)則的幾何外形，表面凸凹不平，表面結(jié)合較為緊密，同時集聚體整體性較強，說明山藥低聚糖是一種較為固定緊密的立體結(jié)構(gòu)。

a-35倍；b-4 000倍；c-11 000倍；d-35 000倍圖4 山藥低聚糖不同倍數(shù)的掃描電鏡圖Fig.4 SEM image of yam oligosaccharides with different multiples

2.4 山藥低聚糖對五種益生菌體外生長曲線的影響

圖5-a、圖5-d中，青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌均在30 h達(dá)到最大值，但2種菌的OD600值均小于添加低聚木糖和葡萄糖的培養(yǎng)基；在圖5-b、圖5-c、圖5-e中，兩歧雙歧桿菌在前18 h在山藥低聚糖培養(yǎng)基中生長最快，BB-12雙歧桿菌在18 h達(dá)到最大值，羅伊氏乳桿菌在前12 h在山藥低聚糖培養(yǎng)基中生長最快，能夠發(fā)現(xiàn)在整個生長周期中，3種菌的OD600值均略低于葡萄糖組成的培養(yǎng)基，同時均高于益生性較好的低聚木糖培養(yǎng)基。

以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的長雙歧桿菌在28 h達(dá)到穩(wěn)定期[18]，這和圖5的實驗結(jié)果相符。低聚木糖是公認(rèn)的具有較好效果的益生元[19-21]，觀察圖5-b、圖5-e，能夠發(fā)現(xiàn)山藥低聚糖對兩歧雙歧桿菌和羅伊氏乳桿菌的增殖效果與低聚木糖相似，說明山藥低聚糖具有良好的益生性。張澤生等[22]則指出不同來源的低聚果糖會使得BB-12雙歧桿菌的體外增殖效果不同。由圖5-c可知，BB-12雙歧桿菌培養(yǎng)到18 h，達(dá)到穩(wěn)定期，同時能夠發(fā)現(xiàn)山藥低聚糖的增殖效果低于葡萄糖，但明顯高于低聚木糖，表明山藥低聚糖對于BB-12雙歧桿菌具有較好的增殖作用。

2.5 不同組分山藥低聚糖對三種益生菌體外生長曲線的影響

由圖6可知，在山藥低聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，益生菌的OD值最大，這表明山藥低聚糖最適添加量為1.5%，低聚糖濃度較高時，OD值不再升高，可能是因為溶液的滲透壓較高抑制了益生菌的生長。

由圖7-a、圖7-b、圖7-c可知，3種益生菌(羅伊氏乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、BB-12雙歧桿菌)的OD600值在18 h達(dá)到最大，隨后趨于平緩，說明3種益生菌的前18 h是生長期。山藥低聚糖的3個組分對于羅伊氏乳桿菌增殖效果為Fr1>Fr2>Fr3，這可能是和組分的分子質(zhì)量不同有關(guān)，分子質(zhì)量低的組分益生效果較好；山藥低聚糖的3個組分對于兩歧雙歧桿菌的增殖效果為Fr2>Fr1>Fr3；山藥低聚糖的3個組分對于BB-12雙歧桿菌的增殖效果為Fr1>Fr2>Fr3。通過數(shù)據(jù)圖能夠看出，F(xiàn)r1和Fr2對益生菌的增殖效果較好，而Fr3對益生菌的增殖效果較差，這可能是因為分子質(zhì)量較小時，益生菌更容易利用，而分子質(zhì)量較大可能造成益生菌消化吸收的速率較慢。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)山藥低聚糖Fr1對BB-12雙歧桿菌以及羅伊氏乳桿菌增殖效果較好，而山藥低聚糖Fr2對兩歧雙歧桿菌的增殖效果較好，對于山藥低聚糖不同組分會促進(jìn)不同益生菌的增殖生長，這在國內(nèi)外報道中尚屬首次。

a-青春雙歧桿菌；b-兩歧雙歧桿菌；c-BB-12雙歧桿菌；d-嬰兒雙歧桿菌；e-羅伊氏乳桿菌圖5 山藥低聚糖對五種益生菌體外生長曲線的影響Fig.5 Effects of yam oligosaccharides on the growth curves of five probiotics in vitro

圖6 不同含量山藥低聚糖對益生菌的影響Fig.6 Effects of different contents of yam oligosaccharides on probiotics

國內(nèi)外研究表明，碳水化合物促進(jìn)益生菌的增殖生長主要是和單糖組成、聚合度、糖苷鍵類型以及益生菌的培養(yǎng)條件和種類有關(guān)。山藥低聚糖促進(jìn)益生菌的生長可能與聚合度、糖苷鍵組成有關(guān)，需要進(jìn)一步探究。

a-羅伊氏乳桿菌；b-兩歧雙歧桿菌；c-BB-12雙歧桿菌圖7 三種組分山藥低聚糖對三種益生菌生長曲線的影響Fig.7 Effects of three yam oligosaccharides on the growth curves of three probiotics

2.6 不同組分山藥低聚糖對益生菌影響的顯著性分析

圖8為不同組分山藥低聚糖對益生菌的影響。由圖8可知，在3種菌中，添加不同組分山藥低聚糖的培養(yǎng)基相較于無糖培養(yǎng)基均具有顯著性(P<0.05),且Fr1和Fr2顯著高于無糖組(P<0.05)，同時Fr1和Fr2兩組相較于Fr3組具有顯著性(P<0.05)；在BB-12雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌中，F(xiàn)r1和Fr2之間有差異，但不顯著(P>0.05);在羅伊氏乳桿菌中，F(xiàn)r1組和Fr2組不存在顯著性差異(P>0.05)，與上述結(jié)論一致。

圖8 三種組分山藥低聚糖對三種益生菌的顯著性分析圖Fig.8 Three components of yam oligosaccharides on the three probiotics significance analysis注：不同小寫字母表示差異顯著

3 結(jié)論

經(jīng)粗提得粗山藥低聚糖經(jīng)過活性炭色譜柱，乙醇進(jìn)行梯度洗脫，再通過Sephadex LH-20 凝膠色譜柱得到數(shù)均分子質(zhì)量分別為0.74、0.94、1.25 kDa 3個組分山藥低聚糖;以粗山藥低聚糖作為培養(yǎng)基的唯一碳源，對BB-12雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌和羅伊氏乳桿菌有增殖作用，且效果優(yōu)于純低聚木糖培養(yǎng)基，OD600值分別提高了13.9%，8.24%和7.18%;山藥低聚糖組分對兩歧雙歧桿菌，BB-12雙歧桿菌以及羅伊氏乳桿菌增殖效果分別為Fr2>Fr1>Fr3、Fr1>Fr2>Fr3、Fr1>Fr2>Fr3。