酸豬肉脂肪和蛋白質在發(fā)酵保藏中的變化及對營養(yǎng)價值的影響

趙珠蓮，常榮，范曉文，周才瓊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

酸肉是滇、黔、渝、湘、桂等地區(qū)傳統(tǒng)特色發(fā)酵肉制品，酸肉主要以新鮮豬肉為原料，添加食鹽和淀粉類調料，利用環(huán)境微生物進行厭氧發(fā)酵而成。通常在發(fā)酵15 d后開始產酸，可開始食用直至食用完畢，食用周期長達半年或更長時間。發(fā)酵既是傳統(tǒng)酸肉的風味形成方式，也是一種傳統(tǒng)的食物保藏方式。蛋白質和脂肪是肉類主要的營養(yǎng)素，采用發(fā)酵的方式保藏豬肉，由于長時間微生物及產酸的影響而成為酸豬肉，其中脂肪和蛋白質的氧化降解產物對酸肉營養(yǎng)、衛(wèi)生和滋味品質有重要影響。

蛋白質和脂肪是肉類食品主要組成成分，其在發(fā)酵及發(fā)酵保藏中的變化是形成發(fā)酵肉制品風味成分的重要底物。根據(jù)VENTANAS等[1]和SOYER等[2]研究，脂質氧化與蛋白質氧化產物相關性明顯，苦味、咸味、腐臭味等與其有關。在發(fā)酵保藏過程中，蛋白質降解所產生的小分子物質通過Strecker降解和Maillard反應產生許多風味物質，適當?shù)谋２貢r間可以使發(fā)酵肉制品獲得更好的風味，但保藏期過長則可能產生異味，對肉制品風味產生影響[3]。一方面蛋白質降解產生的肽類和游離氨基酸是發(fā)酵肉制品鮮美滋味品質的重要組成成分[4-5]；另一方面保質期可影響發(fā)酵肉的品質，造成蛋白質微觀結構改變和持水力降低，導致酸肉的營養(yǎng)價值降低[6-7]。產生醛、醇、酮、酯等風味化合物的重要途徑是脂質氧化，風味化合物有50%以上來源于脂質氧化[8]，但肉制品中脂質的過度氧化會產生腐臭哈喇味和大量自由基等有害物質，影響人體的健康。

酸肉作為一種流行于西南地區(qū)的特色傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，目前在國內的相關研究報道主要集中在微生物菌群篩選與鑒定[9]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[10]、營養(yǎng)安全評價[11]及風味形成[12]等方面，且大多是對天然發(fā)酵酸肉樣品采集后進行的研究，或者是研究其風味形成的短期發(fā)酵等。鑒于酸肉是西南地區(qū)民眾的一種食物保藏方式，以及一直采用這種發(fā)酵的方式保藏豬肉，使實際的發(fā)酵時間長至半年以上，而這方面的研究少見報道。為此，我們研究了長時間發(fā)酵保藏過程中豬肉的主要成分蛋白質和脂肪的變化及可能的對酸肉營養(yǎng)價值的影響，以探究傳統(tǒng)酸肉以發(fā)酵的方式保藏的最佳食用期和最長可食期，為引導健康消費等提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、秈米、食鹽，購于重慶北碚天生永輝超市。

HCl、乙醇、乙酸鎂、氧化型谷胱甘肽、石油醚(30～60 ℃沸程)、硫代巴比妥酸、冰乙酸、硫代硫酸鈉、碘化鉀、三氯甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、可溶性淀粉、KH2PO4(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

索氏脂肪提取器，重慶北碚化學儀器廠；FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；L8900全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；722型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；等。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵酸肉的制備及樣品處理

新鮮豬肉，洗凈控水，切成約5 cm×5 cm×1 cm的薄片，加入質量分數(shù)為5%食鹽和10%米粉(秈米炒至金黃，冷卻后粉碎過40目篩)，混勻裝壇，新鮮棕葉塞住壇口、倒扣，水密封。(20±3) ℃下發(fā)酵至180 d。取不同發(fā)酵時段樣品分析(蛋白質氨基酸組成采用瘦肉樣品，其他指標肥瘦各半)。

1.3.2 脂肪酸組成分析

參考鄭捷等[13]的方法，對酸肉樣品進行處理和脂肪酸組成的測定。

樣品處理：取一定量待測樣品絞碎并準確稱取5 g，在(103±2) ℃烘至恒重。將烘干試樣和擦拭過表面皿的脫脂棉共同放進襯有脫脂棉的濾紙筒中，擦拭表面皿的脫脂棉用石油醚潤濕。用索氏抽提器抽提，石油醚作為抽提劑，抽提劑每10 min回流1次，抽提至少6 h。抽提后的溶液40 ℃旋轉蒸發(fā)，蒸干其中有機溶劑，得游離脂肪。取25 μL游離脂肪與2 mLV(苯)∶V(乙醚)=1∶1溶液混合搖勻，再加入0.5 mol/L KOH甲醇溶液2 mL，45 ℃恒溫水浴20 min，加入10 mL高純水，混勻，靜置，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾，取樣液0.5 μL進樣分析。

色譜條件：色譜柱HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為氦氣。流速1.0 mL/min，分流比30∶1，壓力80 kPa，進樣口溫度230 ℃。起始溫度150 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持15 min。質譜條件為離子源溫度250 ℃，電離方式EI，掃描質譜范圍為全掃描。

1.3.3 氨基酸組成分析

蛋白質氨基酸組成分析樣品處理參考韋誠[14]的方法。將樣品表面黏附的米粉刷凈，稱取肉樣200 mg于15 mm×150 mm試管中，加入6 mol/L HCl 10 mL，振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細到4～6 mm，抽真空10 min后封管。處理過的試管置于(110±10)℃恒溫烘箱沙浴水解22 h，取出放至室溫，搖勻過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，60 ℃恒溫水浴蒸干濾液后加入0.02 mol/L HCl稀釋6倍，用0.22 μm濾膜過濾上機分析。

游離氨基酸組成分析樣品處理參考TANIMOTO等[15]的方法略作修改。準確稱取2 g樣品，向其中加入0.02 mol/L稀HCl 15 mL，充分均質后超聲清洗5 min，然后冷凍離心機離心10 min(5 000 r/min，4 ℃)，取上清液。將剩余殘渣加入0.02 mol/L稀HCl 10 mL后攪拌，再次離心5 min(5 000 r/min，4 ℃)，合并上清液并定容至50 mL。取2 mL樣液加入2 mL質量分數(shù)為8%的磺基水楊酸溶液，再次離心10 min(10 000 r/min，4 ℃)，然后經(jīng)0.22 μm水相過濾膜過濾，上機測定。

分析條件為分離柱4.6 mm × 60 mm，洗脫液流速0.4 mL/min，柱溫70 ℃，柱壓12.627 MPa；反應柱柱溫135 ℃，柱壓1.078 MPa；茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min。

1.3.4 脂肪及蛋白質氧化產物分析

硫代巴比妥酸值(thiobarbitutric acid，TBA)測定參考李新等[16]方法。準確稱取5 g試樣于錐形瓶中，加入10 mL 75 g/L(含1 g/L乙二胺四乙酸)的三氯乙酸溶液。振搖30 min后過濾；吸取5 mL濾液(取5 mL蒸餾水作空白對照)于試管中，加入0.02 mo1/L TBA溶液5 mL，加塞并搖勻，沸水浴40 min后置于室溫45 min，加三氯甲烷5 mL，混勻，靜置分層，上清液在532 nm和600 nm處測吸光度，與TBA反應的物質的量用1 kg肉中丙二醛的質量(mg)表示，按照公式(1)計算：

(1)

式中：A1和A2為溶液在532、600 nm的吸光度。

多肽氮(polypepide nitrogen，PPN)測定參照陳東華[17]方法，準確稱樣10 g，加入5%(體積分數(shù))三氯乙酸50 mL，勻漿均質后5 000 r/min離心30 min，取上清液于分液漏斗中與等體積乙醚混勻，收集下層溶液，定容至50 mL。采用常量雙縮脲法測定。

標準曲線繪制：配置系列質量濃度(0、2、4、6、8、10 mg/mL)氧化型谷胱甘肽溶液，各取1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，混勻，置于室溫30 min，于540 nm處比色測定。以氧化型谷胱甘肽濃度和測得的OD值進行標準曲線繪制，得標準曲線回歸方程為y=0.099 4x-0.021 5，R2=0.997。

氨基態(tài)氮(amino nitrogen，AN)測定參考李華麗[18]方法，在酸堿滴定法測定總酸的基礎上，加入10 mL中性甲醛溶液，滴定至pH 9.20，記錄消耗堿的量(V)，根據(jù)公式(2)計算(以氮計)：

(2)

其他成分中揮發(fā)性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N)測定參考GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》，半微量定氮法；脂肪測定參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》；過氧化值(peroxide value，POV)測定參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》中滴定法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

結果以平均值±標準差表示，n=3；采用Origin 2018作圖，SPSS 25.0進行單因素方差分析和相關性分析。P<0.01表示極顯著，P<0.05表示顯著。

2 結果與分析

2.1 脂肪在酸豬肉發(fā)酵及發(fā)酵保藏中的變化及對營養(yǎng)價值的影響

2.1.1 脂肪在酸豬肉發(fā)酵及發(fā)酵保藏中的變化

如圖1所示，發(fā)酵前期脂肪含量緩慢降低，在90 d 后下降迅速(P<0.05)。發(fā)酵至180 d時，脂肪含量僅為未發(fā)酵時的61.79%。脂肪在發(fā)酵保藏中的降解，可降低酸肉脂肪含量，形成酸肉風味，但是長時間以發(fā)酵方式保藏酸豬肉引起的脂肪下降，可導致脂質過氧化產物大量增加，影響品質。

圖1 脂肪含量在發(fā)酵過程中的變化Fig.1 Changes of fat content in fermentation

2.1.2 脂肪氧化產物對酸豬肉營養(yǎng)價值的影響

POV和TBA分析結果如圖2所示。隨發(fā)酵時間延長，POV在發(fā)酵保藏前期緩慢增加，45 d后快速上升(P<0.05)，120 d時為0.525 g/100g，超過了GB 2730—2015《食品安全國家標準腌臘肉制品》中咸肉的POV≤0.50 g/100g的規(guī)定，表明以發(fā)酵方式保藏酸豬肉在100 d內為宜。繼續(xù)保藏，脂肪的持續(xù)降解可產生哈喇味和黃變，影響感官品質。

酸肉TBA值隨發(fā)酵保藏時間延長顯著增加(<90 d，P<0.05)，后期趨緩，TBA峰值在發(fā)酵至180 d時仍遠低于SORENSEN等[19]報道的肉發(fā)出腐臭異味的TBA閾值(5 mg MDA/kg)。在60～90 d時，POV上升較緩，而TBA升勢明顯，推測脂肪在此期間產生次級氧化產物如丙醛、丙二醛以及一些風味物質等的速率高于產生初級氧化產物的速率，可能對酸肉風味形成有重要影響[20]。

圖2 POV及TBA在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.2 Changes of POV and TBA in sour pork fermentation

2.1.3 脂肪酸組成在發(fā)酵及發(fā)酵保藏中的變化

為進一步了解酸豬肉發(fā)酵保藏中脂肪降解情況，分析了脂肪酸組成在發(fā)酵保藏中的變化(表1)。未發(fā)酵豬豬肉共檢出21種脂肪酸，飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)11種，占總脂肪酸含量的45.01%，主要是C16∶0和C18∶0；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)4種，占總脂肪酸39.09%，主要是油酸；多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)6種，占總脂肪酸的15.90%，主要是C18∶2n6。表明新鮮豬肉脂肪組成以飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸為主。

隨發(fā)酵保藏時間延長，PUFA不斷降解，亞麻酸、γ-亞麻酸和二十碳三烯酸未被檢出，花生四烯酸在發(fā)酵保藏后期僅檢出微量。SFA和MUFA在發(fā)酵保藏前期略有增加，45 d時PUFA相對含量最低，表明PUFA的不穩(wěn)定性及在發(fā)酵前期發(fā)生了快速降解；隨發(fā)酵保藏時間延長，PUFA占比逐漸回升(圖3)，表明發(fā)酵后期脂肪的快速降解來自SFA和MUFA的下降。說明短期發(fā)酵脂肪酸的降解主要來自PUFA，長時間發(fā)酵可導致所有的脂肪酸發(fā)生降解。

表1 酸豬肉脂肪酸組成及相對含量在發(fā)酵中的變化 單位：%

2.2 蛋白質在發(fā)酵及發(fā)酵保藏中的變化及對酸豬肉營養(yǎng)價值的影響

2.2.1 酸豬肉蛋白質氨基酸組成及在發(fā)酵保藏中的變化

如表2所示，未發(fā)酵豬瘦肉含16種氨基酸(由于色氨酸在6 mol/L HCl條件下全部破壞，故未檢出)，從氨基酸含量變化看，蛋氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸和天冬氨酸等在發(fā)酵中增加，與發(fā)酵0 d樣品相比，分別增加了25.11%～31.83%、1.79%～154.86%、8.02%～12.15%和6.49%～12.06%，蛋氨酸是肉類食物的限制性氨基酸，其在發(fā)酵中的增加可提升豬肉蛋白質的營養(yǎng)價值?？偟鞍自诎l(fā)酵中呈波動并略有下降，發(fā)酵保藏至180 d時為發(fā)酵0 d時的89.76%(圖4)。

分析酸豬肉中必需氨基酸(essential amino acids，EAA)和非必需氨基酸(non-essential amino acids，NAA)的變化(圖4)，發(fā)酵0 d豬瘦肉EAA總量為7.28%，占總氨基酸的40.49%；EAA/NAA為68.04%，表明豬瘦肉是理想的蛋白質來源[21]。隨發(fā)酵保藏時間延長，EAA占比增加，高值出現(xiàn)在發(fā)酵45～150 d(圖5)，表明發(fā)酵保藏可提升豬肉蛋白質氨基酸的營養(yǎng)價值。參照FAO/WHO EAA基準模式對酸肉蛋白進行氨基酸評分(amino acid score,AAS)，結果見表3。發(fā)酵保藏期間，蛋氨酸(Methionine，Met)和半胱氨酸(Cysteine，Cys)的含量升高，限制性氨基酸從蛋氨酸轉變?yōu)槔i氨酸(Valine，Val)和蘇氨酸(Threonine，Thr)，說明發(fā)酵是提升豬肉蛋白質營養(yǎng)價值一種好的食品加工和保藏方式。

圖4 EAA和NAA在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.4 Changes of EAA and NAA in the fermentation of sour pork

圖5 EAA/NAA和蛋白質在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.5 Changes of EAA/NAA and protein in sour pork fermentation

2.2.2 蛋白質降解產物對酸豬肉營養(yǎng)價值的影響

為進一步了解蛋白質的變化，分析了蛋白質相關降解產物。結果如圖6、圖7所示，隨發(fā)酵保藏時間延長，多肽氮和氨基態(tài)氮先增后減，高值分別出現(xiàn)在發(fā)酵90 d和120 d。表明延長發(fā)酵時間可導致蛋白質持續(xù)降解，這可能與發(fā)酵中產酸導致的pH值下降使肉中酸性蛋白酶活性提高有關[22]，多肽氮和氨基態(tài)氮含量增加對形成酸肉風味有利，但繼續(xù)降解可能導致腐敗變質。

圖6 多肽氮和氨基態(tài)氮在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.6 Changes of peptide nitrogen and ammonia nitrogen in sour pork fermentation

圖7 TVB-N在酸肉發(fā)酵中的變化Fig.7 Change of TVB-N in sour pork fermentation

蛋白質腐敗變質指標TVB-N隨發(fā)酵保藏時間延長不斷增加(P<0.05)。120 d時快速上升，表明酸肉蛋白質腐敗變質加速，150 d時達31.85 mg/100g，是發(fā)酵保藏120 d時候的2.4倍；此時TVB-N高于國標規(guī)定的鮮(凍)畜禽產品中TVB-N限量標準1倍(≤15 mg/100g)；高于腌豬肉SB/T 10294—2012規(guī)定的一級品標準限值(≤20 mg/100g)，但低于腌豬肉SB/T 10294—2012規(guī)定的二級品標準限值(≤45 mg/100g)。至發(fā)酵保藏180 d時TVB-N仍在腌豬肉二級品標準限值內。根據(jù)腌豬肉SB/T 10294—2012規(guī)定的一級品標準限值(≤20 mg/100g)標準，酸豬肉發(fā)酵保藏時間在103 d內為宜。

2.2.3 游離氨基酸組成在酸豬肉發(fā)酵保藏中的變化及對營養(yǎng)價值的影響

如表4所示，經(jīng)發(fā)酵后，酸肉中大部分游離氨基酸的含量隨發(fā)酵時間延長呈先增后減的趨勢，高值出現(xiàn)在90～120 d，包括谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸等，其中蘇氨酸高值出現(xiàn)在60 d。說明在這期間，酸肉的風味最為醇厚和豐富。組氨酸和精氨酸在0 d時均未檢出，在這之后蛋白質水解產生了組氨酸與脯氨酸，在發(fā)酵保藏120 d時達到峰值。氨的含量也隨發(fā)酵時間延長先增后降，90 d達到最高值。

如圖8所示，游離氨基酸總量在90 d前及發(fā)酵保藏過程中，呈現(xiàn)先顯著增加(P<0.05)后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢。說明在微生物作用下，蛋白質的降解及引發(fā)的游離氨基酸含量的變化有助于肉制品風味的形成，后期下降可能與游離氨基酸繼續(xù)降解或與其他物質反應生成重要的揮發(fā)性風味物質如醇、醛、酮和酯等有關[23]。TOLDRA等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在火腿的加工中，隨著加工時間的延長，游離氨基酸的含量越高，火腿的風味也就越香濃，所以游離氨基總量的增加對于酸肉風味的形成有重要的影響。分析各呈味氨基酸占比顯示，由高到低依次為鮮甜味氨基酸、苦味氨基酸、酸鮮味氨基酸，表明發(fā)酵保藏可提升酸豬肉的風味。

表4 酸肉發(fā)酵及發(fā)酵保藏中游離氨基酸組成變化 單位：mg/kg

FAA-呈味氨基酸總量；SU/FAA-酸鮮味氨基酸占比； US/FAA-鮮甜味氨基酸占比；B/FAA-苦味氨基酸占比圖8 游離氨基酸總量和呈味氨基酸占比在發(fā)酵保藏中 的變化(濕基)Fig.8 Changes of total free amino acids and taste amino acids in fermentation and preservation (wet base)

經(jīng)過對酸豬肉呈味游離氨基酸在發(fā)酵保藏中的變化進行分析，以酸甜味氨基酸(絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸和甘氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和蛋氨酸)和鮮酸味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)[25]分別對各發(fā)酵時段各呈味氨基酸進行計算，如圖9所示，發(fā)現(xiàn)三類呈味氨基酸含量均出現(xiàn)先升后降的趨勢，高值均出現(xiàn)在發(fā)酵保藏90 d。

圖9 呈味氨基酸含量在發(fā)酵保藏中的變化Fig.9 Changes of flavor amino acid content during fermentation and preservation

3 結論

從脂肪降解及脂肪酸組成變化看，新鮮豬肉脂肪組成以SFA和MUFA為主。隨發(fā)酵保藏時間延長，酸豬肉脂肪酸的種類有一定的減少，脂肪含量逐漸下降，短期發(fā)酵主要是PUFA降解，長時間發(fā)酵保藏可導致所有脂肪酸發(fā)生降解。從脂肪降解產物看，TBA和POV隨發(fā)酵保藏時間延長逐漸增加，TBA在全發(fā)酵時段均低于限值，POV值在發(fā)酵時間超過100 d時超過GB 2730—2015規(guī)定限值。

從蛋白質降解及氨基酸組成變化看，發(fā)酵使豬肉第一限制性氨基酸蛋氨酸及半胱氨酸含量升高，使蛋白質的AAS升高；發(fā)酵保藏中產生的游離氨基酸隨發(fā)酵保藏的進行呈先增后減的變化趨勢，發(fā)酵保藏90 d時游離氨基酸含量達到峰值，此時酸鮮、鮮甜、苦味氨基酸的含量最高，占比最高的是鮮甜味氨基酸；從蛋白質降解產物看，多肽氮和氨基態(tài)氮高值出現(xiàn)在發(fā)酵90 d和120 d；TVB-N值則持續(xù)增加，經(jīng)計算豬肉TVB-N值在發(fā)酵保藏103 d時超過限量標準。這些變化表明發(fā)酵及發(fā)酵保藏可提升酸豬肉蛋白質的營養(yǎng)價值，適當?shù)陌l(fā)酵保藏時間可提升酸豬肉風味。綜上，以發(fā)酵方式保藏酸豬肉的時間在100 d內為宜。