基于組學技術的冠心病血瘀證候研究進展

趙夢竹，呂雙宏，王恒和*

(1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 3001932;2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300193)

2018年《中國心血管病報告》[1]中指出2016年中國城市居民冠心病(coronary heart disease，CHD)死亡率為113.46/10萬，且呈上升趨勢，冠心病的防治迫在眉睫。中醫(yī)藥在冠心病防治中具有獨特的優(yōu)勢[2]，能夠改善患者的生活質量，減輕焦慮抑郁狀態(tài)，減少再住院率。中醫(yī)藥防病、治病的精髓在于辨證論治，辨證準確、規(guī)范，療效事半功倍。但是，傳統的中醫(yī)辨證體系客觀依據較少，中醫(yī)證候診斷的主觀性較強，給中醫(yī)臨床辨治帶來一定困難。因此，其規(guī)范化、標準化亟需解決。多年來，中醫(yī)和中西醫(yī)結合工作者在中醫(yī)證候客觀化、規(guī)范化研究方面做了大量工作，其中對血瘀證的研究較多。血瘀證是冠心病最為常見的證候類型，目前對血瘀證[3]的診斷標準日趨完善，近幾年來基于三大組學技術的血瘀證候研究為冠心病的中醫(yī)臨床辨治提供了重要參考，綜述如下。

1 冠心病血瘀證基因組學研究

1.1 CHD血瘀證與CYP2C19*2基因

張婭等[4]采用PCR-RFLP法對冠心病PCI術后氣虛血瘀證患者外周靜脈血進行CYP2C19*2基因多態(tài)性檢測并進行單因素分析，以非氣虛血瘀證組為參照進行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現氣虛血瘀證組CYP2C19*2基因突變型(GA+AA)高于非氣虛血瘀證組，且相對危險度(OR)為2.465，提示冠脈介入術后CYP2C19*2基因突變可能是易患氣虛血瘀證的原因。胡樑臣等[5]對冠心病不同程度血瘀證患者CYP2C19*2基因多態(tài)性進行探究發(fā)現，重度血瘀證患者發(fā)生基因突變的例數、應用氯吡格雷治療后不良反應情況多于輕度血瘀證者，提示CYP2C19*2基因多態(tài)性、氯吡格雷抵抗與重度血瘀證有密切聯系。

1.2 CHD血瘀證與ACE基因

李琳等[6]對早發(fā)冠心病血瘀證患者ACE基因選取3個單核苷酸多態(tài)性rs4343、rs4293和rs4267385進行相關性研究，發(fā)現ACE基因多態(tài)性位點rs4293、rs4267385的基因型相似，與健康對照組比，位點rs4343中G等位基因頻率高且攜帶G等位基因者患早發(fā)CHD的風險是非G等位基因攜帶者的3.6倍，對性別、年齡、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等風險因素用Logistic回歸分析進行校正后仍具有統計學意義，OR值為3.994，這提示ACE基因位點rs4343(G2350A)多態(tài)性可能是早發(fā)CHD發(fā)病的危險因素之一，但可能不是早發(fā)CHD血瘀證的易感因素。胡志希等[7]研究發(fā)現早發(fā)CHD血瘀證DD基因型及D等位基因頻率明顯高于早發(fā)CHD非血瘀證及正常對照組，并對一氧化氮(NO)及內皮素(ET)進行檢測，發(fā)現早發(fā)CHD血瘀證患者ET/NO檢測值明顯高于早發(fā)CHD非血瘀證及正常對照組，且以DD型血瘀證患者最高，表明ACE基因DD基因型及D等位基因與早發(fā)CHD血瘀證發(fā)病相關，DD基因型是早發(fā)CHD血瘀證的獨立危險因素，可增加早發(fā)CHD的風險，D等位基因是早發(fā)CHD血瘀證的易感基因。宋曙霞等[8]在探究CHD血瘀證患者血管病變數與ACE基因多態(tài)性的相關性研究中發(fā)現ACE基因DD、I/D型患者血管狹窄支數較Ⅱ型多，其血瘀程度亦較重，提示CHD血瘀證患者血管病變數與ACR基因多態(tài)性有關。李建軍等[9]運用PCR方法對冠心病血瘀證患者測定ACE基因多態(tài)性和eNOS基因G894T變異，并以冠心病非血瘀證患者為對照，比較其基因頻率，發(fā)現冠心病血瘀證患者ACE基因DD、I/D型者病情嚴重程度較Ⅱ型高，存在多支病變。

劉南等[10]研究發(fā)現在我國漢族急性心梗后患者中發(fā)生心室重塑與ACE基因多態(tài)性有關，提示ACE基因多態(tài)性可能是其獨立危險因素。李杰等[11]采用單體型相對風險分析(HHRR)和連鎖不平衡檢驗(TDT)的方法對湖南地區(qū)漢族人群冠心病血瘀證家系患者ACE基因I/D多態(tài)性進行探究發(fā)現，ACE基因I/D多態(tài)可能是冠心病血瘀證的發(fā)病危險因素之一，但在冠心病血瘀證家系中尚未發(fā)現與冠心病血瘀證及與疾病基因座存在關聯、連鎖，推測基因座可能不是湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因。

1.3 CHD血瘀證與IL-6/8基因

鄭景輝等[12]采用PCR-RFLP的方法以健康組人群為對照，研究IL-8基因-251(A/T)位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)與冠心病血瘀證遺傳易感性的關系，發(fā)現IL-8-251A/T多態(tài)性位點各基因型頻率和等位基因頻率在CHD血瘀證組中具有明顯差異，且在有家族史的CHD血瘀證組中AT型基因提高患病風險，0R值為4.350，表明IL-8-251A/T SNP AT基因型可增加家族聚集性冠心病血瘀證的易感性。陳光等[13]采用重亞硫酸鹽對冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者(血瘀證和非血瘀證各6例)外周血進行處理并檢測兩組IL-6基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)發(fā)現:IL-6基因轉錄起始位點前-1 118 bp至-826 bp序列中7個位點CpG位點甲基化程度血瘀證組存在高于非血瘀證組的趨勢，但統計學差異不明顯，IL-6基因轉錄起始位點前-1 47 1 bp至-1 184 bp序列4個CpG位點甲基化程度血瘀證組與非血瘀證組之間的差異尚不明顯，此研究認為IL-6基因啟動子甲基化水平在一定程度反映了尿酸(UA)血瘀證本質。

1.4 CHD血瘀證與ApoE基因

陳伶利等[14]采用PCR-RFLP、HHRR和TDT方法，對湖南地區(qū)漢族人群中冠心病血瘀證患者ApoE基因多態(tài)性進行檢測及分析發(fā)現：早發(fā)冠心病血瘀證、非血瘀證均與ApoE基因的ε4基因多態(tài)性關聯，且二者可能均與ApoE的ε4等位基因點連鎖，推測該基因座可能為湖南地區(qū)漢族人群早患冠心病的遺傳易感基因。韓旭等[15]采用基因測序的方法對118例不同證型(陰寒凝滯證、痰濁壅塞證、心腎陰虛證、陽氣虛衰證、心血瘀阻證、氣陰兩虛證)的冠心病患者ApoE基因多態(tài)性進行檢測，檢出3種純合子E2/2、E3/3、E4/4，3種雜合子E2/3、E2/4、E3/4；且與對照組相比，冠心病組E2/4、E3/4、E4/4，ε4等位基因分布頻率增加，E3/3基因型、等位基因分布頻率ε3較其頻率減少；表明ε4等位基因是CHD發(fā)生的遺傳易患因素，并可能與CHD患者心臟事件的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關；ε3等位基因則為CHD發(fā)生的保護因素。袁肇凱等[16]團隊研究亦發(fā)現冠心病心血瘀證組的ε4等位基因和E3/E4基因型的頻率高于對照組，且與血脂相關的TC、TG、LDL-C等3項指標與ApoE-E3/E4都存在著關聯(P<0.05)。

1.5 CHD血瘀證與其他基因

李杰等[17]采用PCR-VNTR方法對冠心病血瘀證PAI-1基因多態(tài)性基因座基因型進行鑒定，利用核心家系資料進行用HHRR、TDT對核心家系資料進行分析發(fā)現：冠心病血瘀證與PAI-1的CA18基因多態(tài)性有關聯或存在連鎖，非血瘀證與PAI-1的CA20基因多態(tài)性無關聯且無連鎖；結果表明PAI-1的CA18等位基因座可能為湖南漢族人群冠心病血瘀證的遺傳易患基因。Zheng GH等[18]采用多重SNaPshot技術，以健康人為對照，對中國漢族人群血小板活化因子受體(PAFR)基因rs5938、rs313152、rs76744145多態(tài)性與冠心病(CHD)和血瘀證(BSS)的相關性進行探究發(fā)現：PAFR基因rs5938或rs313152多態(tài)性可能是中國漢族人群冠心病尤其是冠心病的BSS易感性的潛在生物標志物。薛梅等[19-20]對北京、河北地區(qū)漢族冠心病患者血小板膜糖蛋白IIIa PLA基因、GPIbHPA-2基因多態(tài)性進行研究發(fā)現：GPIIIa PLA1/PLA2多態(tài)位點，GPIb的HPA-2多態(tài)位點不是漢族人冠心病和冠心病血瘀證的危險因素，相關的易感基因可能存在于其他多態(tài)位點中。徐長福等[21]采用PCR-RELP的方法對浙江局部地區(qū)漢族冠心病血瘀證患者的基質金屬蛋白酶-3(MMP-3)基因多態(tài)性進行檢測，發(fā)現血瘀證組患者5A等位基因頻率高于對照組，提示MMP-3-1612 5A/6A基因多態(tài)性與血瘀證相關，5A等位基因可能是血瘀證遺傳易感基因。廖江銓等[22]采用高通量測序技術，熒光定量PCR技術篩選出與CHD血瘀證相關的39個lncRNA，229個miRNA和221個mRNA，并進行功能通路分析，發(fā)現與免疫、炎癥有關的lncRNA-miRNA-mRNA差異表達基因譜構建了基因調控網絡，CTA-384D8.35，CTB-114C7.4，RP11-567M16.6和hsa-miR-3158-3p為該網絡中的關鍵節(jié)點。譚光波等[23]研究發(fā)現vWF基因MspI多態(tài)性中，M-M-基因型與M-等位基因與冠心病血瘀證發(fā)生相關，且可能為其獨立危險因素；Fg基因-148多態(tài)性中，TT基因型與冠心病血瘀證發(fā)生相關，T等位基因可能與冠心病發(fā)生相關。

2 冠心病血瘀證代謝組學研究

代謝組學在整體性、系統性及動態(tài)性方面與中醫(yī)學整體觀念、辨證論治的特點不謀而合。基于此，有學者[24]提出了“證治代謝組學”假說，即機體受各種致病因素的刺激和影響后人體代謝網絡功能發(fā)生特異性變化，不同中醫(yī)證候以及辨證論治后存在體內代謝物組方面的特征性差異；并以冠心病為研究載體，以“證”為切入點，闡釋了“證治代謝組學新假說的概念與內涵、背景、依據、實踐思路、特色及臨床意義”，為冠心病中醫(yī)證候代謝組學研究提供了理論參考。冠心病血瘀證代謝組學研究較多，其新近代表性研究如下。

2.1 血漿代謝組學研究

2.1.1 核磁共振法

史琦等[25]用核磁共振法對冠心病血瘀證患者血漿進行檢測，以非血瘀證、健康組為對照，篩選出2種特異性代謝產物：纈氨酸和丙酮，這提示冠心病血瘀證的異常代謝可能涉及氨基酸和脂質代謝過程。張紅栓等[26]對冠心病患者血漿進行檢測發(fā)現血漿中低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂類化合物、酮體、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白含量均高于血瘀證組，高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸含量均低于血瘀證組，提示兩組在脂代謝、糖代謝均存在紊亂，且痰濁組程度更重。

2.1.2 氣相色譜-質譜聯用法

魏星和簡維雄均采用氣相色譜(GC)-質譜(MS)聯用技術，以冠心病非血瘀證和健康人組為對照，探尋冠心病血瘀證血漿中的代謝標志物。魏星等[27]研究發(fā)現L-纈氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-絲氨酸能將冠心病與健康組分離開，且含量較健康組降低；在區(qū)分血瘀證組與非血瘀證組時，膽固醇、木糖醇含量有差異，還有包括L-纈氨酸、丙氨酸、花生四烯酸等44種物質對分類有貢獻。這提示脂質代謝紊亂可能是CHD血瘀證的代謝特征之一。簡維雄等[28]對CHD患者血漿進行檢測發(fā)現，血漿中脯氨酸、亞油酸含量在CHD非血瘀證組水平下降，血瘀證組上升，由此推斷脯氨酸、亞油酸含量可能是區(qū)分CHD是否為血瘀證的物質，但并非能區(qū)別CHD與健康組。同時，葡萄糖在血瘀證組表現為含量顯著升高，與健康組比差異無統計學意義，在非血瘀證組表現為含量下降，與健康組比無統計學差異。本研究最終確定花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、檸檬酸、β-羥基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸為CHD心血瘀阻證血漿代謝產物譜。這提示能量 (脂肪、葡萄糖)代謝紊亂與CHD心血瘀阻證有密切聯系。周耀中等[29]運用超高效液相色譜/質譜(UHPLC/MS)聯用的方法探究心絞痛血瘀證血清學特點，發(fā)現血瘀證患者血清中檸檬酸含量減少,肉毒堿、組氨酸、黃嘌呤含量增多(VIP>1且P<0.01)，檸檬酸、肉毒堿、組氨酸、黃嘌呤為內源性代謝標志物，涉及能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝、嘌呤分解代謝多個環(huán)節(jié)。趙琳琳等[30]在前期冠心病患者對比健康人血清的代謝組學研究的基礎上，篩選出CHD血瘀證的潛在特異性標志物：膽堿、β-葡萄糖、α-葡萄糖和酪氨酸。楊小芳等[31]探究了冠心病氣虛血瘀證和氣滯血瘀證患者血清代謝組學的特點，發(fā)現組氨酸及瓜氨酸為二者的差異物,且在氣虛血瘀證升高的更為明顯。

2.2 尿液代謝組學研究

2.2.1 核磁共振法

張紅栓等[32]采用核磁共振法對冠心病患者尿液進行檢測，發(fā)現CHD痰濁證組尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸、葡萄糖、3-羥基丁酸、丙酮、酪氨酸、肌酐、氧化三甲胺、二甲胺、馬尿酸的含量高于血瘀證組。王娟等[33]在對CHD尿液代謝組學的研究中發(fā)現脯氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、葡萄糖、纈氨酸、組氨酸、馬尿酸等物質的含量在CHD血瘀證組患者尿液中升高，而檸檬酸、肌酸酐、?；撬岬任镔|的含量下降。這提示冠心病除存在脂質、能量代謝紊亂外，還可能存在肝腎功能損傷，脯氨酸可能是CHD血瘀證的生物學基礎。

2.2.2 氣相色譜-質譜聯用法

簡維雄等[34]對CHD患者尿液進行代謝產物鑒定，發(fā)現葡萄糖、甘油、木糖醇、馬尿酸、油酸酰胺、丙酮為CHD心血瘀阻證尿液生物代謝產物譜，亦推斷出心血瘀阻證代謝途徑可能涉及糖、脂肪、蛋白質三大物質代謝，肝腎損傷亦可存在于其中。李靜等[35]對CHD血瘀證大鼠尿液代謝組學的研究中亦發(fā)現冠心病血瘀證的病理機制涉及層面廣，以能量代謝失衡，基酸代謝、糖代謝、嘌呤代謝紊亂及脂質堆積為主。

3 冠心病血瘀證蛋白質組學研究

3.1 表面增強激光解析離子化飛行時間質譜技術

姚笛等[36]采用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜技術對冠心病急性心肌梗死患者血清進行蛋白質組學的檢測，并以正常人群為對照，研究在冠心病與正常組中找到29個差異蛋白峰，其中M/Z 1 562.79等9個差異蛋白峰在冠心病組中呈高表達，M/Z 1 501.44等20個差異蛋白峰在冠心病組中呈低表達，M/Z 4 649.81和M/Z 9 536.92兩個差異蛋白峰組成的生物標記物能夠將冠心病組和正常對照組很好地區(qū)分；在冠心病痰瘀證組和血瘀證組中找到35個差異蛋白峰，M/Z 1 986.37等12個差異蛋白峰在痰瘀組和血瘀組中呈高表達；M/Z 4 980.48等8個差異蛋白峰在痰瘀組和血瘀組中呈低表達；另有M/Z2 242.14等15個差異蛋白峰在痰瘀組中呈高表達，在血瘀組中呈低表達。M/Z 8 654.96、M/Z 2 081.65、M/Z 18 667.3和M/Z 2 242.14四個差異蛋白峰組成的生物標記物能將痰瘀組和血瘀組樣本很好地區(qū)分。并用決策樹的方法建立了冠心病和冠心病痰瘀證血清蛋白預測模型。

3.2 同位素標記相對和絕對定量技術

肖隋熙等[37]用同位素標記相對和絕對定量(iTRAQ)技術對冠心病血瘀證和非血瘀證患者血清進行分離，鑒定得到780個蛋白質，有27個蛋白質點在兩組中有差異，其中11個涉及免疫反應、細胞間粘附作用(血小板參與的凝血反應、脂質代謝上調)的蛋白質點上調,16個涉及血小板細胞變形、細胞與細胞間關系遷移、細胞損傷表達下調的蛋白質點下調。劉燁[38]研究發(fā)現冠心病血瘀證患者與健康人之間有12個蛋白質點。

3.3 雙向凝膠電泳聯合質譜技術

周倩倩等[39]研究找到冠心病血瘀證患者和健康人組之間血清6種差異蛋白質：視黃醇結合蛋白4(RBP4)、載脂蛋白E(ApoE)、載脂蛋白A1(ApoA1)、CD5抗原樣蛋白(CD5L)、結合珠蛋白(Hp)、血清白蛋白(ALB)，推測上述蛋白質可能與CHD血瘀證有關。

3.4 高解析離子淌度質譜(HDMS)與納升級超高效液相色譜(UPLC)聯用技術

趙慧輝等[40]采用高解析離子淌度質譜(HDMS)與納升級超高效液相色譜(UPLC)聯用的方法，并去除冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者和健康人血漿中6種豐度最高的蛋白后對冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血漿進行進行無標記定量蛋白質組分析找到總蛋白數3 843種，差異蛋白數25種,上調蛋白數13種(Haptoglobin、SAA、CP、C6、MYH11、APOH和ANXA6，及心絞痛血瘀證患者獨有蛋白3種，ACTA1、ITIH3和LBP),下調蛋白數12種(HBB、HBA、HBE、HBD、HBG、HRG、IGHG、GSN和TF)。

4 結語與展望

中醫(yī)藥作為中華民族的瑰寶，辨證論治貫穿于整個疾病的診治過程，傳統的中醫(yī)學在繼承先人經驗的基礎上辨證論治存在較大的主觀性，在精準醫(yī)療的時代，如何使辨證更加精確、客觀是目前亟待解決的問題。冠心病的診斷金標準是造影檢查，其有創(chuàng)性和副作用限制了冠心病早期篩查，不能很好地區(qū)分穩(wěn)定性與不穩(wěn)定性心絞痛?；蚪M學、蛋白質組學和代謝組學具備動態(tài)性、整體性、系統性的特點，作為新的橋梁，將病與證相結合，更好的為中醫(yī)病證結合、辨證論治提供客觀化證據，推動中醫(yī)藥走向世界。目前基于三大組學的冠心病血瘀證的研究揭示了冠心病血瘀證患者在凝血、炎癥因子、脂質、糖類、氨基酸及能量代謝方面存在相應的變化，且代謝紊亂往往是多方面的，揭示了其機理的復雜性。

目前對冠心病中醫(yī)證候組學特點的研究中，存在樣本量小、單中心、病程不一等問題，中醫(yī)證候診斷影響納入分組，繼而影響組學的結果，中醫(yī)證候診斷標準規(guī)范化也是目前亟待解決的問題之一。三大組學的檢測受到年齡、性別、飲食等環(huán)境的影響，篩選出的生物標志物關系、作用通路及機制需要進一步研究，這有助于為探究藥物治療作用機制及尋找藥物靶點提供依據。在研究過程中，組學提供的數據量較大，如何有效地分析這些海量數據仍是組學研究中的難點[41]。目前冠心病血瘀證的組學研究多基于病證結合，無法排除疾病本身對生物標志物的影響。因此基于組學技術的冠心病血瘀證研究需要橫向與縱向相結合，既要對血瘀證在冠心病中的組學特點研究，又要對血瘀證在其他疾病中的組學特點進行研究，這可能更符合中醫(yī)學異病同治、同病異治的治病原則。