基于c-ring探討活血化瘀法經(jīng)ATP5G1改善心力衰竭的作用機(jī)制

孫大偉，馮麗莎，吳曉翠，楊 旭 ，楊 希，索艷榮

心力衰竭(heart failure，HF)是多種原因誘導(dǎo)的心臟結(jié)構(gòu)異常改變，致使心功能發(fā)生障礙，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，是各種心臟疾病的終末階段，猝死風(fēng)險極高[1-2]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對心力衰竭的發(fā)病機(jī)制研究較為深入，但是心力衰竭的病理生理機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為主要與能量代謝障礙、體液因子的改變、心室重構(gòu)、細(xì)胞大量凋亡、過度自噬、氧化應(yīng)激、離子缺陷及炎癥反應(yīng)等有關(guān)[3-5]。由于現(xiàn)有的治療藥物具有不良反應(yīng)較多、作用靶點單一的缺點，致使心力衰竭易反復(fù)發(fā)作，無法做到根治。因此，深入挖掘其發(fā)病機(jī)制及探索新的有效治療方法，仍是目前的重中之重。本研究基于C環(huán)(c-ring)的微觀結(jié)構(gòu)，通過分析ATP合酶F0復(fù)合體C亞基1(ATP5G1)的作用進(jìn)一步探討活血化瘀法改善心力衰竭可能的作用機(jī)制，為臨床治療心力衰竭提供理論依據(jù)及新思路。

1 心肌細(xì)胞能量代謝障礙是導(dǎo)致心力衰竭的重要誘因之一

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞能量代謝障礙理論更適合用于闡述心力衰竭的進(jìn)展。病理狀態(tài)下持續(xù)的缺血性心肌損害，可誘發(fā)產(chǎn)能形式的改變，由優(yōu)先利用高效的脂肪酸β氧化逐漸轉(zhuǎn)化為低效葡萄糖的無氧酵解，有學(xué)者將這一現(xiàn)象定義為“代謝重塑”[6]。該過程可導(dǎo)致游離脂肪酸和乳酸等代謝產(chǎn)物的堆積，并產(chǎn)生脂毒性和葡萄糖毒性，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和呼吸鏈，誘導(dǎo)膜電位下降，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)開放，線粒體水腫、崩解，細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)生成減少，心肌細(xì)胞死亡[7]。此外，代謝重塑亦可啟動心肌細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)心肌纖維化，心室重構(gòu)，進(jìn)而加速心力衰竭進(jìn)程[8]。近年來，改善心肌能量代謝的藥物日益受到青睞，逐漸成為新型藥物研發(fā)的主流。2018年《中國心力衰竭診斷和治療指南》[9]對于該類藥物的臨床應(yīng)用給予了充分的肯定，并進(jìn)行了積極正向的推薦，指出：“心肌細(xì)胞能量代謝障礙在心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮一定作用，使用改善心肌能量代謝的藥物，如曲美他嗪、輔酶Q10、輔酶Ⅰ、左卡尼汀、磷酸肌酸等可以改善病人癥狀和心臟功能，改善生活質(zhì)量”。因此，心肌細(xì)胞能量代謝障礙是導(dǎo)致心力衰竭的重要誘因之一，改善能量代謝可進(jìn)一步阻止心室重構(gòu)，防治心力衰竭，具有巨大的潛力。

2 c-ring變構(gòu)是導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙的重要病理基礎(chǔ)

ATP合酶(ATP synthase)的微觀結(jié)構(gòu)：ATP synthase是參與能量代謝的關(guān)鍵酶，在心肌能量生成過程中起著舉足輕重的作用[10-11]。ATP synthase又稱F1F0 ATP synthase，是由多種亞基組成的復(fù)合體，但主要由F1與F0構(gòu)成，其中F0主要由a、b、c等亞基組成，其中c亞基呈同心圓狀排列，亦被稱為c-ring。而F1則含有α、β、γ、ε 等亞基，其頂部外形呈橘瓣狀，主要是由α和β相互交叉、環(huán)形分布而組成的六聚體，而γ和ε亞基則呈棒狀，位于六聚體的中央，其上端與α、β亞基相連，下端與c-ring相連[12-15]。ATP synthase合成ATP的工作原理主要是旋轉(zhuǎn)催化機(jī)制，即通過特定亞基旋轉(zhuǎn)得到的機(jī)械能轉(zhuǎn)換為化學(xué)能的過程[16]。能量產(chǎn)生由c-ring的高速旋轉(zhuǎn)驅(qū)動，進(jìn)而把質(zhì)子跨膜信號傳遞到F1的頂部，觸發(fā)β亞基構(gòu)象發(fā)生交替變化來催化ATP 的合成[17-18]。

有研究表明，c-ring變構(gòu)可誘發(fā)mPTP開放，這是心肌細(xì)胞能量代謝障礙的重要病理基礎(chǔ)：c-ring的中空內(nèi)部由F1的γ和ε亞基填充，并與之緊密相連[19]。c-ring相當(dāng)于ATP synthase的轉(zhuǎn)子，而γ和ε亞基則組成ATP synthase的定子。心力衰竭時，在一些病理因子的刺激下，如細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高及鈣離子超載可導(dǎo)致c-ring與γ和ε亞基被迫分離，而這一過程觸發(fā)了mPTP的過度開放[20]。mPTP是存在于線粒體內(nèi)外膜之間的一種非特異性通道，生理情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，病理狀態(tài)下mPTP開放，可導(dǎo)致線粒體膜電位去極化，線粒體腫脹、破裂，最終引起ATP合成受阻[21-22]。c-ring作為產(chǎn)能“關(guān)鍵裝置”，對mPTP的調(diào)控具有重要的調(diào)節(jié)作用。Bonora等[19]用小干擾RNA轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(一種易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株)，抑制具有穩(wěn)定c-ring結(jié)構(gòu)作用的因子三磷腺苷合酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1，ATPIF1)的表達(dá)，并將其置于高濃度的鈣離子中誘導(dǎo)mPTP開放，結(jié)果顯示大量消耗的ATPIF1能夠促進(jìn)mPTP的開放，導(dǎo)致線粒體膜電位顯著下降。有研究通過觀察mPTP的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，c-ring可能是mPTP的重要組成部分[23]。以上研究表明c-ring與mPTP之間的關(guān)系極為密切，c-ring的結(jié)構(gòu)改變可直接影響mPTP的狀態(tài)。因此，穩(wěn)定c-ring結(jié)構(gòu)，抑制mPTP開放，可能是新型藥物的研發(fā)及治療心力衰竭潛在的分子靶點。

3 c-ring接受ATP5G1的調(diào)控

c-ring的結(jié)構(gòu)：同一物種內(nèi)，核基因編碼的c-ring相對分子量與結(jié)構(gòu)高度保守，c亞基的N端和C端與相鄰亞基的對應(yīng)位置通過α螺旋連接，并形成兩個發(fā)夾式的同心圓，這些同心圓雙向向外擴(kuò)展，進(jìn)一步形成圓柱形的疏水孔[24-25]。c-ring直徑最小的環(huán)和中心軸之間的相互作用提供了ATP synthase轉(zhuǎn)子的膜內(nèi)和膜外部件之間的關(guān)鍵連接，因此，c-ring必須足夠堅固，才能抵御電機(jī)在最高300 Hz轉(zhuǎn)速下的高速轉(zhuǎn)動所引起的離心力。當(dāng)核基因表達(dá)異常時，c亞基重新排列，誘導(dǎo)c-ring結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，促進(jìn)mPTP開放。

ATP5G1是參與編碼c-ring的主要核基因之一[23，26]，其異常表達(dá)是導(dǎo)致c-ring結(jié)構(gòu)改變的誘因。研究證實通過替換關(guān)鍵的甘氨酸使ATP5G1發(fā)生基因突變，可以促使鈣離子介導(dǎo)的mPTP的開放更為敏感，而這一過程與c-ring的重組有關(guān)[19]；實驗表明，過表達(dá)的ATP5G1能夠引起c-ring排列疏松，從而導(dǎo)致ATP合成受阻，細(xì)胞凋亡[23]。那么是否核基因表達(dá)下調(diào)對機(jī)體能量合成更為有利？答案是否定的。有研究顯示，ATP5G1 mRNA表達(dá)顯著降低可誘發(fā)線粒體的破裂，ATP生成同樣減少[27]；另有研究報道，通過siRNA的方法使ATP5G1敲除，則可導(dǎo)致細(xì)胞磷酸化活性顯著降低，最終引起能量合成障礙[28]。以上表明ATP5G1對c-ring構(gòu)象的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。因此，ATP5G1更像是調(diào)控機(jī)體能量代謝的“開關(guān)”，目前利用選擇性地操縱c-ring這一原理，臨床已開發(fā)出一系列抗菌藥物，然而對心力衰竭的進(jìn)展中ATP5G1的變化研究甚少。

4 活血化瘀法對核基因ATP5G1的影響

《金匱要略·水氣病脈證并治》曰：“心水者，其身重而少氣，不得臥，煩而躁，其人陰腫”與《素問·評熱病論篇》載：“諸水病者，故不得臥，臥則驚，驚則咳甚也”，以上兩段古籍中記錄的癥狀與心力衰竭較為相符。根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)將心力衰竭歸屬于“喘證”“水腫”“心悸”的范疇。本病病位主要在心，涉及肝、肺、脾、腎，病機(jī)總屬本虛標(biāo)實，血瘀貫穿疾病始終。血瘀由血液運(yùn)行失常而產(chǎn)生，無論阻滯于脈內(nèi)或是脈外，均可影響心、肝、脾、腎、肺等臟腑組織的功能。如血瘀留滯于心，導(dǎo)致心脈閉阻，氣血運(yùn)行不暢，可見心悸；“血瘀必兼氣滯”，血瘀留滯于肝，可致肝失疏泄，阻礙氣機(jī)，氣機(jī)不暢，脾腎通調(diào)水道失職，膀胱氣化失司，水邪泛濫，發(fā)為水腫；血瘀阻滯于肺，可致肺失宣降，肺氣脹滿，呼吸不利而致喘。因此，血瘀既是病理產(chǎn)物，同時又是導(dǎo)致心力衰竭的重要誘因。若能針對血瘀之病機(jī)，活血通絡(luò)，勢必將振奮陽氣，給水邪以出路，達(dá)到治療心力衰竭的目的?！度数S直指方·虛腫方論》創(chuàng)用活血法治療瘀血水腫，療效甚佳，沿用至今。張洋等[29]研究了活血化瘀方劑對心力衰竭大鼠心功能的影響，發(fā)現(xiàn)采用活血化瘀法可以明顯改善心力衰竭。另有研究報道，劉強(qiáng)教授采用活血化瘀法，臨證辨證加減治療瘀水互結(jié)之心衰，收效顯著[30]。

丹參是活血化瘀的代表性藥物，應(yīng)用廣泛，療效確切，更有“一味丹參，功同四物”之說，是臨床治療血瘀型心力衰竭之要藥?！度杖A子本草》曰：“破宿血，補(bǔ)新生血”；《本草便讀》言：“活血之力有余，為調(diào)理血分之首藥”。丹參素是丹參發(fā)揮活血化瘀作用最重要的有效成分。因此，前期本課題組采用丹參素進(jìn)行藥物干預(yù)，結(jié)果顯示：濃度為10 μmol/L丹參素可以明顯降低大鼠心肌細(xì)胞mPTP的開放程度，促進(jìn)ATP生成，增強(qiáng)心肌收縮力，進(jìn)而改善心肌損傷，其作用機(jī)制可能與參與下調(diào)ATP5G1 mRNA表達(dá)有關(guān)。為了進(jìn)一步證實這一理論，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，使ATP5G1過表達(dá)，結(jié)果顯示丹參素抑制mPTP開放的效應(yīng)被顯著削弱[31]，這為活血化瘀法對ATP5G1的調(diào)節(jié)作用提供了實驗依據(jù)。

5 小 結(jié)

活血化瘀法發(fā)揮心肌保護(hù)的作用機(jī)制可能與通過參與調(diào)節(jié)ATP5G1表達(dá)，穩(wěn)定c-ring結(jié)構(gòu)，減少mPTP開放，進(jìn)而改善心肌細(xì)胞能量代謝有關(guān)。若能證實這一猜想，則對于治療心力衰竭具有一定的科學(xué)價值。改善心肌能量供給已成為防治心力衰竭的重要目標(biāo)，科研工作者仍在不遺余力地探索新的有效藥物及治療方法。深入挖掘中醫(yī)治法對ATP5G1的調(diào)控機(jī)制具有以下兩方面重要意義：一方面為活血類藥物治療血瘀型心力衰竭提供了實驗依據(jù)；另一方面則有助于闡述心力衰竭的發(fā)病機(jī)制，并基于c-ring構(gòu)象研發(fā)敏感的治療藥物，這將為臨床心力衰竭的治療提供新思路及干預(yù)靶點。