骨髓間充質干細胞聯(lián)合3D生物打印技術治療骨缺損的研究進展

袁宇，徐林

前言

骨缺損是一項臨床常見的問題，常由創(chuàng)傷、感染、腫瘤或一些先天性疾病所造成［1-2］。目前臨床中骨缺損的主要手術方式是采用自體骨或異體骨移植，但手術治療中存在著機體創(chuàng)傷大、移植物來源有限及其潛在的免疫應答風險，考慮到患者的營養(yǎng)狀態(tài)及基礎疾病因素且存在術后感染和并發(fā)癥等缺點，極大限制了其應用。近年來，骨髓間充質干細胞（BMSCs）在基因工程、骨組織工程中的價值在基礎研究和臨床中得到廣泛關注及應用發(fā)現(xiàn)并報道［3］，因其來源豐富、易培養(yǎng)且增殖能力強、低免疫原性和基因轉染率高并能穩(wěn)定表達的特點，在特定誘導條件下可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等分化，通過旁分泌參與組織修復并介導免疫應答［4-6］。目前被認為是組織工程中的理想種子細胞，為骨缺損的治療提供新的思維方向及應用前景。利用BMSCs依附在適當?shù)闹Ъ茌d體上再造組織或器官是目前臨床研究的重點［7］。2001年Mastrogiacomo等［8］報道了以羥基磷灰石為支架結合BMSCs 的方法成功治療了3 例骨缺損患者。隨后又有大量的實驗及臨床研究證實了BMSCs結合支架材料治療骨缺損的可行性［9-10］。目前生物3D 打印技術是將種子細胞及特定的支架材料按照預設的構建模型再造出特定的組織及器官，因其建模的精確性且不存在免疫排斥反應在基礎醫(yī)學及臨床中得到廣泛關注，是一種新興的有廣泛發(fā)展前景的骨缺損治療技術。本次研究就BMCSs 的骨組織工程技術結合3D 打印載體治療骨缺損的應用研究進行綜述。

1 BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

1.1 BMCSs的分離培養(yǎng)

目前間充質干細胞主要來源是自體骨髓和臍帶組織，分化來源于中胚層［11］，因其優(yōu)秀的增殖并且具有誘導多向分化能力、低免疫原性和不存在倫理問題在干細胞組織工程中得到廣泛研究和應用。因骨髓間充質細胞含量少，細胞數(shù)量和活性隨著年齡的增長逐漸減少，在實驗及臨床應用中受限，所以要獲取數(shù)量充足且有活性的BMSCs必須依賴體外分離培養(yǎng)及擴增技術。

BMSCs在不同個體和不同年齡段中細胞活性和數(shù)量各不相同，目前在人體中的來源提取主要是取自髂骨和腰椎弓板和棘突［12］。目前實驗室中BMSCs分離培養(yǎng)的主要方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、表型分離法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分選法等［13］。全骨髓貼壁法和密度梯度離心法操作簡單經濟、獲取目的細胞效率較高，是目前最常用的分離方法［14］。免疫磁珠分選法與流式細胞儀分選法分離過程較復雜且價格較高，應用并不廣泛。

隨著對BMSCs 研究的系統(tǒng)化和規(guī)范化，機體本身BMSCs 的獲取數(shù)量有限，有研究者提出誘導多功能干細胞（induced Pluripotent Stem Cells,iPSC）替代的BMSCs 概念。iPSC 易獲取、來源廣泛，沒有取材時引起的副損傷等優(yōu)點，并且同樣擁有多向誘導分化能力，在未來臨床治療中是BMSCs 的一種優(yōu)秀的替代來源，從而具有重要的應用價值［15］。雖然目前對iPSC 的誘導研究發(fā)現(xiàn)其分裂增殖能力優(yōu)越，但增殖過程中缺乏可控性，有潛在成瘤生長的可能，在其培養(yǎng)和應用中還需要更深入的研究［16-17］。

1.2 BMCSs的鑒定

分離提純的BMSCs在外觀上呈體積較小的梭形細胞、核漿比大，隨著間充質干細胞的分離提取方法的多樣化，國際間充質干細胞委員會也提出了BMSCs 的鑒定標準，主要針對分離出的細胞進行免疫表型的篩選要求，常用的方法有免疫熒光染色法和流式細胞術，BMSCs 通常表達CD90、CD105、CD73，較少表達CD19、CD79、CD45、CD34、CD14 和HLA-DR 表面分子［18-19］。雖然BMSCs 的分離培養(yǎng)趨于多樣化和標準化，但目前還沒有其特異性的免疫標志物進行鑒定分離［20］，在BMSCs 的篩選純化方面還需要進一步的研究［21］。實驗室中對分離提純的BMSCs監(jiān)測其誘導成骨分化是否成熟常用其分泌產物進行分析，常用的有堿性磷酸酶（ALP）和骨涎蛋白。

1.2.1 ALP 在BMCSs 鑒定中的應用ALP 由成骨細胞分泌，在成骨過程中水解磷酸酯、啟動鈣化程序，是成熟成骨細胞最重要的標志酶，也是最常用來監(jiān)測的工具酶，可以通過檢測ALP 的含量及活動判斷成骨細胞的分解代謝水平及分化成熟程度。ALP 作用于鈣離子使其在骨基質上聚集沉積完成基質鈣化，在鈣化初始時ALP 活性最高，隨著鈣化的進行ALP 逐漸下降。ALP 染色法是最常用的檢測方法，通常用Von Kossa 法、茜素紅法染色等可顯示礦化結節(jié)，目前RT-PCR 技術可定性定量地檢測ALP 活性以幫助分析成骨細胞成骨過程中的動態(tài)變化［22］。

1.2.1 骨涎蛋白在BMCSs 鑒定中的應用骨涎蛋白主要是由成骨細胞產生，破骨細胞和成齒細胞也有少量合成，其活性與ALP 在成骨過程中的動態(tài)變化不同，在成骨細胞成熟的過程中骨涎蛋白的含量呈遞增的趨勢，與鈣化過程呈正相關，對血清或血漿中的骨涎蛋白含量的測定可判斷成骨細胞的分化階段，結合ALP 的定量檢測可以較準確地分析出分化各階段成骨細胞的活性。骨涎蛋白可與I型骨膠原的α-2鍵結合，占到非膠原的骨基質的5%～10%，這種特性也使骨涎蛋白作為一種促血管形成因子，在組織修復和重建中具有重要作用［23］。除此之外骨鈣素是僅有成骨細胞可以合成分泌的酸性蛋白，在鈣化初期表達較旺盛，也是檢測成骨細胞分化成熟特異性較高的標志酶。

2 BMSCs分化的影響因素

目前已知有多種細胞因子、化學藥物和一些物理刺激如機械應力、氧濃度、電磁場和超聲波等都對BMSCs增殖分化起到調控作用。早期的研究者發(fā)現(xiàn)在BMSCs 的體外培養(yǎng)中，加入富血小板血漿可以促進其分裂增殖［24］，后來人們在血漿等體液中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并提純了許多促進BMSCs 的生長因子，對BMSCs的增殖及誘導分化的研究更加系統(tǒng)和深入。

2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）對BMSCs分化的影響

BMP-2 屬于轉化生長因子β（Transforming Growth Factor-β,TGF-β）超家族，是目前基礎醫(yī)學及臨床中應用最廣泛的成骨誘導生長因子，因其具有誘導BMSCs 向軟骨細胞和成骨細胞定向分化的能力，成骨作用效果顯著且穩(wěn)定，與ALP 具有協(xié)同作用，且能獨立誘導成骨過程［25-26］，成為骨組織工程中重要的成骨誘導劑［27-28］。

BMP-2 來源廣泛，在BMSCs、成骨細胞、軟骨細胞中均有表達，主要作用于間充質干細胞及成骨細胞［29］。BMP-2 在體內環(huán)境下通過誘導BMSCs 向骨母細胞分化成熟進而誘導成骨，修復骨折損傷部位骨組織［30］，在成骨修復過程中介導成骨細胞與破骨細胞的骨吸收重建過程，在誘導成骨及成軟骨過程的同時促進血管內皮因子表達增加，進而促進損傷部位循環(huán)系統(tǒng)的修復重建，并介導周圍炎癥及免疫應答促進組織的修復，在移植排斥反應和自身免疫性疾病的治療中具有重要作用［31-34］。最近研究發(fā)現(xiàn)除了BMP-2，BMP-6、BMP-7、BMP-9 在促進BMSCs成骨分化中具有協(xié)同作用，亦具有較強的誘導效果［35］。

2.2 激素對BMSCs的成骨分化作用

目前雌激素在成骨分化的作用上得到廣泛證實，低濃度的雌激素有促進成骨的作用，這也被應用在預防女性絕經后骨質疏松癥等方面［36-38］。地塞米松常用于抗自身免疫性疾病的治療中，研究者在動物實驗中發(fā)現(xiàn)地塞米松可以促進BMSCs的成骨及成軟骨分化，并存在濃度依賴性，低濃度呈現(xiàn)誘導分化作用，高濃度（＞10-8M）呈抑制作用［39-43］。

成骨生長肽（Osteogenic Growth Peptide,OGP）是一類多肽類生長因子。動物實驗中發(fā)現(xiàn)OGP 的BMSCs 誘導成骨分化作用，但誘導分化的過程及結果存在不確定性，具體生化機制還需要進一步研究［44］。

甲狀旁腺激素具有促進破骨細胞活性升高血鈣濃度的作用，最近體外實驗發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺激素在與1，25（OH）2VD3聯(lián)合作用時對BMSCs成骨分化有較強的促進作用，具體分子機制還需要進一步研究［45］。

2.3 細胞因子對BMSCs分化的影響

TGF-β 對BMSCs 的誘導分化存在濃度依賴性，低濃度時促進細胞分裂增殖，高濃度時增殖減少、誘導分化作用增加［46］。血管內皮細胞生長因子（VEGF）是對骨的再生與重建具有重要的作用，能夠促進成骨細胞的遷移和分化。VEGF 與BMP-2 的表達相互調節(jié)相互影響，聯(lián)合應用生長因子對骨缺損修復具有協(xié)同調控的作用［47］。

堿性成纖維細胞生長因子（basic Fibrob1ast Growth Factor,bFGF）是一種常用的促細胞分裂劑，是目前發(fā)現(xiàn)對BMSCs 促分裂增殖能力最強的誘導劑，目前對bFGF 介導細胞分裂增殖過程的分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，其可能與BMP-2 協(xié)同作用促進BMSCs的增殖并誘導成骨分化，有多種細胞因子共同參與，以自分泌或旁分泌形式介導胞內及胞外信號傳導，促進成骨細胞成熟加快骨基質的礦化過程［48-49］。

EPHA2 可通過增加RUNX2 的表達促進BMSCs的成骨分化，如果RT-PCR檢測EPHA2的動態(tài)變化顯示隨著BMSCs成骨分化數(shù)量的提高其表達水平也在提高。整合素是細胞間及細胞內信號傳遞的重要介質，大量的動物實驗證明整合素具有促進BMSCs 成骨分化及增殖的重要作用［50-51］。在BMSCs 分化研究中發(fā)現(xiàn)其在成骨分化與向脂肪細胞分化是競爭性調節(jié)［52-53］，在正常生理條件下兩種分化處于向成骨分化的平成狀態(tài)［54-56］。三磷酸腺苷可使BMSCs 成骨分化相關基因的表達增高，而且可抑制向脂肪分化的基因表達，可能與激活ERK1/2通路有關。

雙膦酸鹽（Bisphosphates,BPs）在臨床中被用來治療老年骨質疏松癥的常用藥［57-58］。最近實驗發(fā)現(xiàn)，藥物濃度的不同對BMSCs的增殖與成骨分化具有較大的影響。低濃度時誘導成骨作用有所增強，但高濃度時抑制BMSCs 的增殖及成骨分化，并展現(xiàn)出一定的細胞毒性促進成骨細胞凋亡，具體機制還需要進一步的研究證實［59］。

最近的研究表明，一些他汀類藥物，甘油磷酸鹽、基質細胞衍生因子-1［60］（Stromal Cell-Derived Factorl,SDF-1）、Vit C 和β-甘油磷酸鈉可通過調控相關基因轉錄、刺激ALP 和骨鈣素的表達、調節(jié)細胞外基質成分［61-64］。Toll 樣受體激動劑、脂多糖［65］，氯化鋰等鋰鈣復合鹽也可通過旁分泌作用介導細胞間信號傳導促進BMSCs增殖及成骨分化過程［66］。

BMSCs的成骨分化受多方面生長因子及蛋白質影響，在細胞間和細胞內多方面信號傳導下調控其增殖及分化方向，所以對相關信號通路的研究至關重要［67］。目前對BMSCs成骨作用及分化成熟相關的信號通路的研究還不成熟，已知的信號通路有骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉化生長因子β 通路［68］、Notch 信號通路［69-70］、Wnt/β-catenin信號通路［71-72］等，相信隨著對信號通路研究的深入，有助于對BMSCs 的分化調節(jié)進行精準調控。

2.4 傳統(tǒng)中藥對BMSCs分化的影響

近年來涌現(xiàn)出很多中藥提取物對促進BMSCs增殖分化的研究，并取得了大量的理論依據(jù)及實驗證實。中藥及提取物具有獲取方便、價格低等優(yōu)勢，并且作用靶點豐富，在作為BMSCs 增殖及定向分化研究方面具有重要應用價值和潛在的發(fā)展前景。

淫羊藿苷是淫羊藿的提取物，是目前研究最早也是最廣泛的BMSCs成骨分化誘導劑，目前大量實驗研究證實了其確切的誘導成骨效果［73］。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對BMSCs的增殖與分化的調節(jié)有Wnt/β-catenin通路、p38MAPK信號通路等多條信號通路共同調控，p38MAPK信號通路促進BMSCs的分裂增殖且保持細胞性能的穩(wěn)定［74］，ERα-Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路可促進其成骨分化［75］。

麝香酮在體內環(huán)境下可促進BMSCs 增殖，其誘導成骨分化能力與藥物濃度呈負相關，即低濃度促進BMSCs 成骨分化［76］。駱駝蓬堿促進了BMSCs 骨形成蛋白的表達而促進成骨分化［77］，鹿茸多肽使骨BMSCs 中ALP 活性增強，間接實現(xiàn)誘導成骨作用［78］。除此之外，像異補骨脂素［79］、齊墩果酸、川芎嗪［80］、二苯乙烯苷、補腎活血湯［81］、巴戟天及龜板及杜仲提取物［82-87］等諸多中藥成分都對BMSCs 的增殖誘導成骨分化具有調節(jié)作用。

2.5 物理因素對BMSCs分化的影響

除了化學因素、細胞內或細胞間的相互作用外，研究者發(fā)現(xiàn)細胞所處的環(huán)境及物理因素對BMSCs自身的代謝調節(jié)和信號傳導也起到重要作用。

2.5.1 培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度、超聲波及電磁場對BMSCs分化的影響在對BMSCs 培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)環(huán)境氧濃度的不同對其增殖產生不同的影響，高氧濃度會促進BMSCs 的成骨分化，低氧則會起抑制作用［88-89］。目前低強度超聲波在臨床尤其是治療骨折延遲愈合和骨不連領域應用越來越廣泛，研究發(fā)現(xiàn)超聲波通過在骨不連區(qū)域制造“微骨折”來影響局部溶骨及成骨代謝的機制治療骨不連，還可通過調節(jié)c-fos 及COX-2 的表達來促進BMSCs 成骨分化和成熟，加快骨基質鈣化過程［90］。近年來研究者在實驗室對大鼠BMSCs 的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)電磁場性質或強度的變化對BMSCs增殖及成骨分化有不同的作用。正弦波及低頻電磁波對BMSCs 成骨分化有促進作用，高頻電磁波則抑制細胞分裂增殖，這可能與細胞內環(huán)磷酸腺苷表達影響細胞代謝水平有關，具體機制還要進一步的研究［91-93］。

2.5.2 培養(yǎng)環(huán)境中力學的變化對BMSCs 分化的影響在體內環(huán)境中骨可對外在機械應力和牽張力產生適應性變化，比如牽張力作用于骨后，成骨相關基因ALP、DcⅣ表達水平增高［94］。近年來研究發(fā)現(xiàn)BMSCs所處環(huán)境的機械力學與其貼附生長的基底剛度對其增殖分化有著重要影響。研究者在實驗中改變細胞周圍力學的性質來觀察BMSCs的動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，細胞外液的剪切力與牽張力使BMSCs向成骨分化增多，而靜水壓力的增高會使成軟骨基因的表達增高促進其向軟骨分化［95］，但具體的機制尚未清晰，可能與細胞間電信號的改變和細胞因子間的相互作用有關，進而調節(jié)基因的表達與蛋白質的合成，且不同組織細胞對機械力的感受器敏感度不同所以其作用效果也有差異［96-98］。

BMSCs 根據(jù)誘導條件的不同可以向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和神經細胞等分化，體外培養(yǎng)時貼附材料基底力學的不同對其分化也可產生不同的影響，即基底支架材料的力學性能也是BMSCs 定向分化的誘導因素，且各種定向分化的適宜材料的力學性能各不相同［99-101］。目前對機械力學與BMSCs的關系研究較少，實驗室中主要是通過改變BMSCs 貼附的支架材料后對干細胞分化進行定性定量分析，間接得到基底的機械力學對BMSCs 增殖分化的影響，也有研究者使用更先進的機械生物反應器來測量機械力學對干細胞增殖分化的影響［102］。隨著對BMSCs 與機械力學相互影響的研究更加深入，為調節(jié)BMSCs的增殖分化和選擇合適的支架材料有了更廣闊的思路，為未來骨缺損的治療提供強大的理論支撐和技術支持。

2.6 BMSCs增殖分化中的雙向免疫調節(jié)性

研究發(fā)現(xiàn)在體內環(huán)境中BMSCs的活性受周圍炎癥因子的影響又反過來調節(jié)機體的免疫應答［103］，這種特性在體外重塑BMSCs載體中具有重要作用。

研究者發(fā)現(xiàn)BMSCs對炎癥反應的調節(jié)具有雙向性和可塑性，具有反饋式雙向免疫調節(jié)性即雙向免疫調節(jié)性，雙向性與炎癥反應的強度和性質密切相關，有NK 細胞、樹突狀細胞、T 淋巴細胞、B 淋巴細胞等多種炎癥細胞參與，一氧化氮合成酶在局部反應中起到重要調節(jié)作用。

炎癥反應所產生的白細胞介素、腫瘤壞死因子α、干擾素-γ［104］等刺激BMSCs 對一氧化氮合成酶的表達增高，一氧化氮合成酶在局部產生NO 抑制T 細胞的活性來發(fā)揮免疫抑制作用。其次BMMSCs可通過旁分泌作用，抑制B淋巴細胞活性及趨化因子的表達減低炎癥反應［105］。另一方面，BMSCs 通過旁分泌表達如RANTES、CXCL-9 等炎性趨化因子，招募周圍的T 淋巴細胞向BMSCs 遷移促進炎癥反應，這在體外實驗中亦得到證實［106-107］。

BMSCs對周圍炎癥的促進或抑制作用多與炎癥反應的水平與刺激有關。目前研究發(fā)現(xiàn)低水平的炎癥反應誘導BMSCs 炎性趨化因子表達增加，并促進成熟T 細胞的增殖促進炎癥反應［108］。相反，當局部IFN-γ、TNF-α 等炎癥因子水平較高時，BMSCs 對一氧化氮合成酶的表達更加活躍，使得T 淋巴細胞及B淋巴細胞活性受抑制，從而起到負向免疫調節(jié)作用［109］。目前對BMSCs 免疫調節(jié)的機制尚存在許多問題，總體來說，BMSCs對免疫調節(jié)的雙向性依賴于炎性反應的強度，而對免疫調節(jié)的結果在總體上是促進骨骼及軟組織的再生與修復［110-111］。

3 BMSCs的臨床應用

3.1 BMSCs在骨疾病中的應用

BMSCs 對于骨、軟骨及肌腱等軟組織修復的治療中具有潛在的應用前景和重要的臨床意義。早期有臨床實驗中將骨髓血引至骨缺損處或直接將分離提純過的BMSCs 通過局部注射的方法，在機體自身體液環(huán)境中誘導BMSCs 成骨分化而修復缺損，目前被廣泛應用在骨缺損、骨折不愈合和骨性關節(jié)炎的臨床實驗和治療中［112］。有研究者將純化后的BMSCs經過成骨誘導與纖維蛋白聯(lián)合通過局部注射的方法治療萎縮性骨不連并取得了良好的治療效果［113］。許多研究結果顯示BMSCs 的自我增殖分化能力對降低股骨頭壞死的發(fā)生具有重要意義［114］。

目前通過BMSCs治療骨缺損的方法有腔內局部注射、復合載體支架填充等方法，這對軟骨和骨缺損具有不同的臨床意義。Osugi 等［115］在體內實驗發(fā)現(xiàn)BMSCs分泌的細胞因子與周圍組織微環(huán)境的相互作用和驅化性，BMSCs 可定向遷移至骨缺損處促進骨折的修復。Dogan 等［116］構建股骨缺損模型，將BMSCs 移植到含硼的聚乳酸一羥基乙酸共聚物（PLGA）支架中，結果顯示，含硼PLGA 支架可提高OC、I型膠原蛋白表達水平。Wei等［117］證實聚己內酯（PCL）支架可以促進BMSCs 增殖和分化，增強骨形成與骨整合。

3.2 BMSCs在其它疾病中的應用

3.2.1 BMSCs 在組織器官修復中的應用在一些肺纖維化等肺部間質性疾病治療中，BMSCs 可通過旁分泌的方式與周圍單核細胞相互作用減少炎性反應，促進炎癥修復而減緩肺部纖維化進程［118］。有一些臨床實驗證實，將自體BMSCs 靜脈注射到急性心肌梗死的患者體內，其心功能得到明顯改善且沒有明顯并發(fā)癥的發(fā)生［119］。這種治療方法在腦梗塞患者治療中亦得到良好的效果，其可減少顱內局部缺血區(qū)炎性細胞的聚集，有效減輕缺血后中樞神經系統(tǒng)損傷，并且在神經功能恢復方面有促進作用［120-121］。

3.2.2 BMSCs 在器官移植中的應用有學者提出由于BMSCs 低免疫原性的特性，能逃避免疫監(jiān)視［122］，行同種異體BMMSCs 移植依然具有優(yōu)秀的治療效果，但在獲取人異體干細胞時要對供體進行病原微生物學與家族史等安全性篩查。目前將自體分離純化后的BMSCs 進行體外擴增，再定向移植到某組織和器官中，經過誘導增殖后修復重建器官已取得了明確的成效，如椎間盤、肝臟［123-125］等。Mohamed等［126］報告指出，BMSCs 在高血壓腎病中具有改善腎小球濾過功能和腎小管重吸收作用，并且可逆轉病理結構，這是現(xiàn)有藥物中所不具備的。

研究發(fā)現(xiàn)其對組織器官的修復不僅是細胞增殖分化作用，BMSCs 分泌的多種生長因子參與調節(jié)組織微環(huán)境，促進周圍血管重建與內源性細胞增殖等［127］。在體內環(huán)境下BMSCs 通過旁分泌對前列腺素E2和TGF-β的調控作用，對自身免疫性疾病、減少免疫排斥等治療提供一種新的思路［128］。目前雖然發(fā)現(xiàn)BMSCs可以分化并修復多種不同類型的組織及器官，但對其修復的具體分子生物學機制尚未十分清晰，總體而言，BMSCs的損傷修復作用一方面是其分化替代能力，另一方面是其與周圍細胞組織及免疫系統(tǒng)的相互作用和旁分泌功能，營造出適宜的微環(huán)境共同調節(jié)組織器官的增殖與分化過程［129-130］。

4 BMSCs復合支架材料修復骨缺損

BMSCs結合支架材料治療骨缺損的研究已有幾十年的歷史，傳統(tǒng)的高分子材料與金屬缺乏天然骨的仿生性和力學性能且易出現(xiàn)免疫排斥反應等并發(fā)癥，不適合應用于BMSCs的載體支架。

4.1 BMSCs復合支架材料在骨缺損的應用

磷酸鈣最早在20 世紀末就被作為骨缺損替代材料之一，磷酸鈣廣泛存在于人體的無機材料中，其具有優(yōu)秀的生物相容性且能調節(jié)體內鈣離子與磷離子的濃度影響骨質礦化，且具有成骨誘導特性被廣泛應用于骨水泥、磷酸鈣陶瓷與骨缺損支架等材料中［131-132］。磷酸鈣骨水泥是常用于骨缺損的填充物，但其脆性大、強度低，在承重方面具有很大缺陷［133］。Boehm 等［134］對磷酸鈣結合了碳纖維材料制成聚磷酸鈣纖維復合材料，改善了材料的韌性和剛度進而大大提高了其作為骨填充物或支架材料的力學性能。成骨細胞是否能在骨缺損替代材料上貼附并增殖決定著支架材料的生物學活性。近年來伴隨著骨組織工程的深入研究，研究者將BMSCs 培養(yǎng)基引入磷酸鈣支架中，其成骨作用提高了BMSCs 的增殖與成骨分化效率亦增強了磷酸鈣支架的生物相容性［135］。

4.2 BMSCs復合支架材料在軟骨缺損的應用

近年來BMSCs復合支架材料制成的三維軟骨修復材料得到了國內外學者的廣泛關注，在相關動物實驗中取得了諸多成果。研究表明BMSCs在成軟骨分化是以逐層分化疊加成多層復合體結構［136-137］。Tali 等［138］將BMSCs 作為種子細胞，結合誘導因子的培養(yǎng)基成功制作出具有生物活性的體外軟骨，并植入在大鼠的骨缺損模型中取得了理想的修復效果，且沒有出現(xiàn)明顯的并發(fā)癥。Cap1an 等［139］在體外利用BMSCs制作成全層軟骨損傷模型再將其植入兔膝關節(jié)處，經培養(yǎng)觀察后發(fā)現(xiàn)損傷模型處長出新生軟骨，同樣達到了損傷修復的目的。

5 生物3D打印技術

生物3D 打印技術是傳統(tǒng)3D 打印技術結合干細胞組織工程技術的擴展運用，是一種新型的快速成型技術。3D 打印技術在上個世紀80年代逐漸開始發(fā)展運用，在近幾十年的發(fā)展中3D 打印技術實現(xiàn)了對需求的個性化、精準化和產業(yè)化，近年來3D生物打印技術蓬勃發(fā)展，在醫(yī)學相關材料的設計與制備取得了重要的成果。

5.1 生物3D打印技術的優(yōu)勢

3D生物打印技術核心的三大構成要素為：干細胞（種子細胞）、支架材料和生長因子。目前骨缺損特別是較大體積的骨缺損是臨床治療中常需面臨的困擾，最常應用于較大骨缺損的治療方法是自體或人工骨移植，但因為二次手術對患者的損傷和材料來源的受限限制了其廣泛應用，且人工骨存在造價昂貴、潛在的免疫排斥風險和構造建模缺乏特異性等弊端。近年來生物3D打印骨缺損得到了越來越多的關注，其解決了人工骨和同種異體骨在免疫排斥和倫理問題方面的缺陷，可在計算機輔助下利用CT、MRI成像技術對骨缺損部位進行精確設計，尤其對于頜面部骨缺損等復雜結構的修復中具有強大優(yōu)勢，并可制造出與缺損骨完全匹配的3D替代支架［140］。

與原始骨缺損填充支架不同的是其在機械強度和微觀空間結構上可與人體骨組織相似，支架材料的無毒性和可溶解性使BMSCs作為種子細胞在支架內三維生長后可達到與缺損骨組織的完全替代整合，是對骨缺損疾病具有廣泛前景的新型治療技術。國內學者張鈺［141］通過3D 打印技術成功設計并制造出了在孔徑結構和力學性能與天然骨質相似的仿生人工踝關節(jié)，在打印精度和材料設計中都取得了重要突破。He 等［142］利用3D 生物打印技術制備了人膝關節(jié)仿生骨假體，具有良好的生物相容性和力學性能，在與人體關節(jié)空間結構匹配精確度方面較傳統(tǒng)人工假體明顯提高。

5.2 生物3D打印技術的打印程序

目前在結合3D 打印的骨組織工程中，如何打印出具有生物活性的載體是研究的熱點。打印過程中溫度過高或局部壓力過強都會導致細胞的失活，種子細胞周圍的基質成分和各種細胞因子所構成的微環(huán)境也極其關鍵。

目前國際中主流的打印程序有兩種：一種方式是需要2 個以上不同特性的打印噴頭，將BMSCs 與原始支架材料同時復合打印，優(yōu)勢是打印完成即具有所需的生物活性，但對打印要求高，打印溫度和打印速度稍有調動即可造成細胞的失活和打印的失敗［143］。另一種是根據(jù)設計的載體材料預先打印出仿生骨的原始支架，再將分離培養(yǎng)的BMSCs 及基質液在原始支架中種植，通過傳代培養(yǎng)和誘導成骨分化后最終形成有活性的三維骨組織修復材料，此種方式是目前最常用于生物骨的打印，優(yōu)勢是操作方便、技術難度低和成活率高，但缺點是培養(yǎng)周期相對較長［144-146］。

5.3 生物3D打印技術的原理

生物3D打印技術的主要步驟為通過醫(yī)學成像在計算機輔助設計建模后，運用適宜的打印技術將原料打印出成品的過程。目前在干細胞組織工程中應用于生物3D 打印技術有噴墨打印技術、選擇性激光燒結技術（Selective Laser Sintering,SLS）、光固化成型技術（Stereo Lithography Apparatus,SLA）和熔融沉積成型技術（Fused Deposition Modeling,FDM）等［147］，3D 打印技術對細胞分布的可控性建模的自由選擇性是應用于骨組織工程的強大優(yōu)勢［148］。每種打印技術都有各自的優(yōu)缺點，不同的環(huán)境溫度、結構應力對生物材料的影響不同，應根據(jù)打印材料的選擇選取合適的打印方法。

噴墨打印是最早被應用的打印技術，但打印精度不高、力學性能較差在仿生骨的生物活性材料中運用較局限。FDM 技術操作簡單、無用損耗少且成本低是目前最常用的生物3D打印技術。其將原材料加熱呈熔溶態(tài)，噴頭在計算機設計程序下將原料噴出，通過逐層累加的方式構建所需模型，但其溫度較高，在打印過程中含藥物載體和細胞中極易損傷變性，所以常先打印固態(tài)支架再在原支架上接種種子細胞進行二次培養(yǎng)的方法獲得生物活性的載體［149］。

Hong 等［150］將聚己內酯/聚乳酸復合材料通過FDM 技術在大鼠的骨缺損模型中得到成功的實驗。SLA 技術在骨組織工程中應用較早，其打印精度較高，材料可在納米級進行操作，常使用聚己內酯、聚乳酸和特殊蛋白質等光敏材料，使用的亦是逐層打印技術，利用材料的光敏性用激光進行定點雕刻而固態(tài)成形［151-152］。SLS 技術與SLA 相似，但取材廣泛，不受光敏性的約束，像羥基磷灰石、PCL 和明膠類蛋白均可采用，在骨和軟骨構建中廣泛實驗和應用［153］。

5.4 生物3D打印的載體及支架材料

在骨組織工程技術的三大要素里，合適的支架材料決定著BMSCs的成活及增殖，支架的力學性能、微觀結構的空隙結構、支架材質仿生性對支架內細胞外微環(huán)境的形成、BMSCs 的成骨誘導分化及其三維生長結構至關重要［154-155］。

5.4.1 生物3D 打印的骨組織支架的必備條件3D 打印的骨組織支架常需要具備以下幾個生物學性能：①支架材料的生物相容性與骨誘導性：移植后不產生免疫排斥反應是移植物成活的基礎也是移植材料發(fā)揮其生物活性的首要前提，這與支架材料的選取、純度有關；材料可與BMSCs 相互作用進而誘導分化為成骨細胞或軟骨細胞［156-158］；②支架材料的空間結構和適宜的孔隙：支架材料表面易于細胞附著，仿生骨材料的活性關鍵在于BMSCs 在支架內的三維生長，所以材料內部孔隙的相互連接至關重要，三維孔隙結構有利于細胞外液的流通，可使生長因子和營養(yǎng)物質均勻作用于種子細胞并為其內血管網絡的建立創(chuàng)造條件，還可將細胞代謝產物通過開放的細胞外微環(huán)境運輸排泄?？讖?、孔隙的分布和密度與支架結構的機械強度密切相關，而且生物支架的降解效率也與支架的孔隙率和表面積有關；③支架的力學性能和機械強度：適宜的機械強度和硬度不僅可以為人體骨骼系統(tǒng)做支撐作用還是對BMSCs完成成骨分化前的保護，BMSCs 在增殖分化過程中對周圍環(huán)境的力學刺激和不同剛度的基底產生反饋作用影響自身的增殖與分化方向，學者們常稱之為機械力學微環(huán)境，是調節(jié)BMSCs 增殖分化非常重要的元素［159-161］。

除此之外，還有由于材料的選擇不同可表現(xiàn)出一些特殊的特性，比如可降解性等。這些諸多的生物學特性與BMSCs及細胞因子共同構成了生物學支架的微環(huán)境，各因素之間的相互作用共同調整著BMSCs的增殖與分化［162］。

5.4.2 生物3D打印骨組織載體及支架材料的選擇在骨缺損3D生物支架材料的選擇中，需要根據(jù)缺損骨的生理功能和受力情況及生物相容性選取適宜的支架材料，還要將BMSCs在支架材料中黏附、增殖和分化等問題考慮在內。目前，應用于生物3D打印的支架材料主要分為兩類：一類是天然高分子生物材料，如膠原蛋白、海藻酸鹽、明膠、纖維蛋白和殼聚糖等［163-165］，其來源廣泛，主要由動植物體內獲?。涣硪活愂侨斯ず铣傻母叻肿由锊牧?，如磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乙醇酸、聚乳酸、聚氨基酸和納米陶瓷類等［166-175］。

目前隨著對3D 打印生物支架功能要求的提高，研究從單一的材料打印技術向復合基因工程、低溫技術和固液相分離技術制作與內環(huán)境鍥合的多功能復合材料轉變。比如打印設計在支架孔隙表面可置的藥物或細胞載體，細胞不但可以在支架表面貼附生長，而且可以復合生長因子、抗菌藥物等制成藥物緩釋的載藥活性支架，聚乳酸就是一種常用的人工合成的聚酯類高分子，可結合3D 打印技術在支架中制作藥物緩釋載體結構預防植入后感染等；還可以利用磷脂雙分子層的微球脂質結構將藥物置入其中制作支架，來達到藥物控釋的目的；利用基因工程將BMP-2 導入復合材料的載體細胞中，達到直接誘導BMSCs成骨分化的目的等［176-180］。

6 常用的生物3D打印骨組織載體及支架材料

目前根據(jù)局部骨缺損的特性構建具有優(yōu)秀的生物相容性、合適的力學性能和空間結構的個性化支架材料是骨組織工程研究的方向，以下是目前研究中流行的支架材料。

6.1 羥基磷灰石

骨的主要礦化無機成分是羥基磷灰石結晶［181］，目前3D生物打印材料多是以人工高分子材料與天然高分子材料相結合，如以羥基磷灰石為原料復合一些如聚乙烯醇、絲素蛋白、鹿瓜多肽等有機材料進行。羥基磷灰石具有優(yōu)秀的組織相容性和骨誘導性［182］，可自行被組織吸收，但其脆性較高，單純運用機械強度欠缺，因其性質活潑、其上化學基團易與離子或其他生物制劑發(fā)生反應，影響支架結構的穩(wěn)定性［183］。

6.2 磷酸三鈣

Solaiman 等［184］以磷酸三鈣為基礎原料運用3D生物打印技術設計出了在力學性能和材料孔隙與天然骨相似的支架材料，并在骨缺損的治療中取得了滿意的效果。β-磷酸三鈣復合羥基磷灰石材料增加了材料的韌性和強度的缺陷且具有促進成骨細胞分化成熟的作用［185-186］。Gronthos等［187］成功運用β-磷酸三鈣混合材料植入干細胞制備出具有正常生物活性的牙槽骨組織。

6.3 海藻酸鹽

海藻酸鹽的化學性質與羥基磷灰石相似，通過對海藻酸鹽的化學修飾與添加其他材料賦予了其作為仿生骨支架更優(yōu)秀的生物學特性，在骨與軟骨材料的支架模型中被廣泛運用。將聚乙二醇與海藻酸鹽制成混合膠體原料，可增強打印材料的韌性和彈性［188］。聚乳酸一羥基乙酸共聚物具有良好的生物相容性，在體內可降解為羥基乙酸與乳酸，材料和降解產物的生物相容性良好，其與海藻酸鹽制成混合材料使干細胞對支架表面的黏附性提高并可促進軟骨的分化成熟［189］。納米碳化羥基磷灰石海藻酸鹽調節(jié)了羥基磷灰石的降解速率，使植入材料與骨組織整合加快并具有誘導神經細胞再生的能力［190］。

6.4 絲素蛋白

體外對BMSCs進行培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中某些蛋白質的含量提高促進了其成軟骨分化，后來人們對其分離純化證明了絲素蛋白對促BMSCs的增殖和成軟骨分化具有促進作用。目前以絲素蛋白做為軟骨支架的組成成分和誘導劑得到了廣泛認同和運用［191-194］。

6.5 殼聚糖

殼聚糖是一種天然氨基多糖，其本身具有抑菌性和可降解性，經過化學修飾或加入其它材料如羥磷灰石可以增強其機械強度在骨和軟骨支架材料的研究中應用廣泛，其親水層易于細胞的黏附增殖，還具有促進骨基質礦化的作用。通過低溫3D生物打印技術將海藻酸鹽與殼聚糖制備出混合材料支架，綜合了兩種材料的優(yōu)勢設計出了生物活性和組織相容性極佳的支架材料［195-196］。Chen 等［197］將殼聚糖與羥基磷灰石經過化學修飾制備出殼聚糖-P24/羥基磷灰石復合材料支架，材料對P24的釋放具有控釋性且可誘導BMSCs 成骨分化，進而提高支架材料與骨質的整合與骨缺損修復效率。

6.6 膠原材料

膠原材料特別是I 型膠原在骨組織工程中應用廣泛，主要參與對軟骨支架材料的構成。膠原復合其他材料在制造軟骨缺損模型和營造骨外微環(huán)境中具有重要作用。將纖維蛋白等整合素加入膠原中制成材料具有促進BMSCs 黏附增殖作用，復合陶瓷制成明膠-陶瓷支架植入種子細胞后促進軟骨分化成熟并促進膠原的分泌合成［198-200］。

凝膠含水量高、保水性能好、結構具有可塑性強等優(yōu)點，還滿足構建人工仿生骨的可降解性的要求，所以在軟骨支架材料中得到關注。水凝膠培養(yǎng)基更適合軟骨結構的生長，梯度交聯(lián)水凝膠使細胞呈3D生長模式，培養(yǎng)基可以模擬體內環(huán)境，對細胞生長增殖和分化等過程進行監(jiān)控和干預。研究者將種子細胞接種在3D 打印的水凝膠基質中制作人耳軟骨支架，并得到了具有生物學活性的仿生耳［201］。透明質酸是一種天然的高分子聚合物也是細胞外基質的組成成分，研究者將透明質酸加入水凝膠中提高了材料的力學性能和生物活性，還促進了細胞對支架材料的黏附性，促進細胞的增殖分化［202］。

6.7 聚乙二醇

聚乙二醇具有良好的水溶性和生物相容性，由聚乙二醇制成的支架材料的韌性和機械強度與軟骨相近［203］，動物實驗中發(fā)現(xiàn)其可以促進軟骨周圍基質的合成分泌［204］。國外學者將成熟的軟骨細胞和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯利用3D打印技術制備出可以直接填補修復的生物活性材料，填補材料不但在機械力學性能與自然軟骨組織相似，在組織成分及內部結構上與軟骨組織更加相容，這也是充分發(fā)揮了3D打印技術對材料堆積的精確控制的優(yōu)勢［205］。Tay等［206］將聚乙烯醇和聚己內酯作為原料，通過3D 打印制備的支架在機械強度、微觀結構的空間孔隙分布和連通性能均取得了較滿意的性能。

6.8 人工高分子與天然高分子復合材料

有研究者將人工高分子材料與天然高分子材料相結合制成復合材料。比如將聚乳酸與羥基磷灰石粉末結合制成復合材料［207］，新材料將羥基磷灰石優(yōu)秀的組織相容性和聚乳酸的材料韌性相結合，不但具有誘導BMSCs增殖分化的能力還改良了傳統(tǒng)材料的機械性能和基底剛度，是骨組織工程材料制備的優(yōu)秀嘗試。與此類似的還有聚醚醚酮（PEEK），PEEK 是一種熔點較高且具有良好的生物相容性的3D 打印材料，因打印材料具有良好的熱穩(wěn)定性得到廣泛關注，除此之外其支架材料的強度高、耐磨性好和良好的韌性是仿生骨材料制備的重要優(yōu)勢［208-209］。賴毓霄等［210］將鎂等金屬材料與PLGA、β-磷酸三鈣采用低溫3D打印技術制備出的復合材料支架材料具有誘導新生血管的長入和BMSCs 成骨分化的作用，并且具有生物可降解性且孔隙率佳，并增加了材料的機械強度。

6.9 生物活性玻璃材料

目前一些生物活性玻璃材料具有抗菌性等生物活性在骨組織支架的研發(fā)中得到廣泛關注。在體外將干細胞中培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)45S5生物活性玻璃可調控基因的表達，使成骨相關基因表達增高，并在動物實驗中發(fā)現(xiàn)其具有促進成骨分化的作用并且誘導周圍血管的長入［211-212］。但是玻璃支架有材料脆性高、機械強度較弱等缺點，有研究者對其復合磷酸鈣、橡膠等材料不斷探索改良其機械強度［213］。

6.10 抗菌材料

移植物感染是移植手術后嚴重的并發(fā)癥，骨的修復能力會因周圍組織的感染、微循環(huán)障礙或機體營養(yǎng)狀態(tài)不佳而受抑制［214］。移植物良好的抑菌性能是生物活性支架發(fā)揮功能的重要前提。由于仿生骨材料需要適宜的空間孔隙和易于細胞貼附的基底，這恰恰也是細菌易在支架材料表面黏附聚集的原因。

3D打印支架材料可將藥品或者抑菌成分如萘夫西林鈉、硝基呋喃妥因等精確打印在支架內部結構中起到抗菌效果，并且可以預先判斷預植物可能感染的菌種設計出特異性抗菌支架，取得了滿意的效果［215-216］。伍衛(wèi)剛等［217］利用生物3D 打印技術制備了一種載藥人工骨，可將抗菌藥物精確堆積，達到藥物控釋性。有研究者提出可利用類固醇的脂質雙分子層結構將抗菌藥物注入其中，這不但可利用類固醇誘導BMSCs 成骨分化，還可加強對骨缺損部位感染的控制能力［218］。但目前3D 打印抗菌材料仍處于初始研究階段，相信其作為抗感染材料的制作技術具有廣闊的應用前景。

7 生物3D打印材料的活性基礎

經過3D生物打印出具有生物活性的支架材料是骨缺損修復的第一步，然而，生物活性支架能否在受體存活受多方面因素的影響，最重要的就是支架材料能否建立有效的血液循環(huán)。良好的血液循環(huán)給予BMSCs生長增殖所需要充足的營養(yǎng)物質并帶走代謝廢物，如果沒有建立必須的循環(huán)微環(huán)境則支架材料中的干細胞及生物活性成分死亡或失效，最終導致移植的失敗并可能出現(xiàn)如感染、自體免疫攻擊等并發(fā)癥。

目前就移植支架多通過添加生長因子如骨涎蛋白、BMP-2、VEGF 等，不但具有誘導成骨分化還可誘導新生血管生成的復合材料，這種具有成骨和誘導新生血管雙重作用的現(xiàn)像叫做成骨-血管生成耦聯(lián)［219］，在骨質和軟組織修復中具有重要意義，還有一些支架材料如β-磷酸三鈣、聚乙烯醇卡拉膠等材料本身也具有誘導血管生成的作用，諸多方法都為3D 生物打印支架移植后的成活建立了研究思路［220］。

隨著3D 生物打印技術的發(fā)展，打印精度越來越高。國內學者從恒河猴取自體干細胞，經過體外增殖分化篩選出種子細胞，利用3D 生物打印技術成功制備出了血管組織，將打印的血管替換了恒河猴體內2 cm 的腹主動脈，術后并無明顯并發(fā)癥的發(fā)生。Lee 等［221］利用活體細胞和組織打印出了直徑1 mm的具有生物活性的血管組織，這一技術使3D 生物打印技術在微米級材料制備中取得了重大突破，這為支架材料建立血液供應提供了有力的技術支持。3D打印血管與傳統(tǒng)人工血管不同，3D 打印的血管管徑不但更細小，而且血管壁結構與天然血管相似，都具有外膜、中膜和內膜結構，這使得血管保持良好的彈性等生物活性［222］。一般移植傳統(tǒng)人工血管的壽命是10年，移植后因移植物材料的原因需要終身使用抗凝藥物，但3D 生物打印出的血管組織具有優(yōu)秀的生物相容性，僅需要在術后5 d 使用抗凝藥且無需更換血管［223-224］。

8 總結與展望

目前，雖然國內外學者對生物3D 打印支架材料的研發(fā)和運用取得了一些進展，但在臨床運用中依然處于實驗階段，BMSCs 的誘導分化及支架材料的取材依然存在許多問題。

BMSCs是骨組織工程中治療骨缺損最理想的種子細胞，但在不同人群和不同年齡中BMSCs 的活性不同，BMSCs在骨髓單核細胞的比例、增殖能力和分化潛能隨著年齡的增長而不斷降低，并不是所有人都具有提取適應癥［225-226］。雖然BMSCs 成骨分化的誘導劑種類諸多，對其細胞間信號傳導通路及作用機制的研究愈加深入和全面，但目前還沒有一種誘導因子能夠實現(xiàn)BMSCs 的精確定向分化，對實現(xiàn)BMSCs體外增殖和分化的可控性依然是研究的熱點和難題。

雖然BMSCs 具有低免疫原性和免疫逃避能力，且可經自體或異體移植，一些動物實驗表明異體移植后BMSCs存活率逐漸下降且活性較低［227］，使得同種異體BMSCs在臨床中的研究與應用較少。目前對BMSCs 的基礎研究在尋找其表面特定標志物，在分離及誘導分化的基礎上向移植后對機體免疫反應的調節(jié)和微環(huán)境的構建進行探索研究。雖然經3D生物打印的支架材料在組織相容性和機械力學方面取得了重要進展，但生物支架在治療骨缺損中缺乏長期病例的隨訪和回顧性研究，而且目前載有BMSCs 的生物活性支架在受體中如何建立有效的血液循環(huán)仍需進一步研究［228］。

3D 生物打印技術經過近幾十年的發(fā)展，在打印技術和精度方面有了顯著的提高，但仍存在一些技術性難題。比如如何將傳統(tǒng)的靜態(tài)打印方式向動態(tài)打印方式轉換，如何在打印過程中使種子細胞免受高溫、壓力等外在因素的干擾依然保持生物活性，怎樣維持各種打印材料之間印刷參數(shù)的兼容性與表征等［229-230］。目前，BMSCs 復合3D 生物打印技術治療骨缺損是一種擁有廣闊前景的治療方法，隨著骨組織工程的發(fā)展和生物活性材料的研發(fā)進步，通過3D生物打印技術為骨缺損患者提供精準化、個性化的治療方案提供可行性，相信未來其在臨床治療中可以發(fā)揮更重要的作用。