外泌體miRNA在腦卒中的作用機制研究進展

王光華，王桂斌，滕曉華

腦卒中患者具有高致死、致殘率及較高的發(fā)病率，因此預(yù)防和治療十分重要[1]。外泌體運輸至靶細胞后激活靶基因，通過修復(fù)神經(jīng)血管單元、抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等治療腦卒中[2-3]。如來源于外泌體miRNA-124的小膠質(zhì)細胞和來源于外泌體miRNA-126的內(nèi)皮細胞參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化的平衡并發(fā)揮抗炎作用。細胞分泌的外泌體為內(nèi)容物復(fù)雜的直徑30～100 nm膜脂結(jié)構(gòu)，包裹和運輸?shù)鞍踪|(zhì)及核酸，包括miRNA。沒有外泌體脂質(zhì)膜包裹的裸露miRNA在血液循環(huán)內(nèi)數(shù)小時會被核糖核酸酶迅速降解，而包裹在外泌體中的miRNAs經(jīng)血液循環(huán)遠距離傳遞至靶細胞發(fā)揮作用。深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA除在外泌體治療腦卒中時發(fā)揮重要作用，同時在腦卒中的診斷和預(yù)后評估中起關(guān)鍵作用。現(xiàn)對多種外泌體miRNA在腦卒中的作用分子機制作一簡要綜述。

1 不同細胞來源外泌體對腦卒中的治療作用

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同細胞來源的外泌體在治療腦卒中時發(fā)揮著重要作用。如體內(nèi)研究表明，脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）來源的外泌體促進M2型小膠質(zhì)細胞極化，顯著減少腦卒中梗死面積；體外研究表明，抑制自噬顯著降低缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，外泌體通過逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)而更有效地抑制小膠質(zhì)細胞極化至M1型[4]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠短暫性大腦中動脈栓塞后立即注射M2小膠質(zhì)細胞來源外泌體后，M1小膠質(zhì)細胞減少，M2小膠質(zhì)細胞增多，M2小膠質(zhì)細胞來源外泌體治療組IL-1、腫瘤壞死因子-α表達低于對照組，IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子-β表達高于對照組，提示M2小膠質(zhì)細胞來源外泌體治療可抑制短暫性大腦中動脈栓塞后的炎癥反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)T2型糖尿病大鼠腦卒中后給予內(nèi)皮細胞來源外泌體治療可增加T2型糖尿病卒中大鼠腦缺血區(qū)域血管密度、軸突和髓鞘密度，提示內(nèi)皮細胞來源外泌體促進血管生成和軸突重塑[6]。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源外泌體穿過血腦屏障對腦卒中發(fā)揮治療作用，運送內(nèi)容物至靶細胞調(diào)節(jié)靶基因。

2 外泌體miRNA對腦卒中的作用

研究表明，外泌體治療腦卒中具有顯著療效，外泌體內(nèi)容物具有復(fù)雜性和差異性等特點，miRNA是外泌體主要內(nèi)容物之一。miRNAs參與細胞增殖、炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡等生理過程，同時一個miRNA可以靶向多個基因，一個基因被多個miRNA靶向作用[7-8]。外泌體將所含miRNAs轉(zhuǎn)移至受體細胞達到治療目的。如MSC來源的外泌體miRNA-17-92和miRNA-133b促進缺血性卒中后軸突重塑和功能恢復(fù)[9-10]。神經(jīng)元來源外泌體miR-132已被報道為介導(dǎo)神經(jīng)血管通訊的細胞間信號[11]。最近的一項研究表明，創(chuàng)傷性腦損傷后小膠質(zhì)細胞來源外泌體miRNA-124增加，通過將miRNA-124轉(zhuǎn)移到神經(jīng)元中，抑制神經(jīng)元炎癥，促進軸突生長[12]。外泌體miRNA對腦卒中起治療作用的有miRNA-124、miRNA-126、miRNA-145、miRNA-30d-5p、miRNA-133b及miRNA-17-92,起診斷作用的有miRNA-30a-5p及miRNA-98-3p等，起預(yù)后評估作用的有miRNA-134等。

2.1 外泌體miRNAs對腦卒中的治療作用

2.1.1 miRNA-126腦卒中死亡的主要原因是心血管疾病和腦損傷[13]。研究結(jié)果顯示，與外泌體miRNA-126治療腦卒中大鼠相比，miRNA-126基因敲除大鼠在腦卒中后心功能顯著降低，心肌肥大、纖維化和細胞炎癥因子表達增加，提示miRNA-126表達降低可能是大鼠腦卒中后心功能不全的原因之一[14]。另一項研究發(fā)現(xiàn)與非糖尿病腦卒中大鼠相比，T2型糖尿病腦卒中大鼠血漿和腦中miRNA-126水平降低，內(nèi)皮細胞來源外泌體miRNA-126治療T2型糖尿病腦卒中小鼠后，血管密度、動脈管徑、內(nèi)分水嶺腦梗死區(qū)域的軸突和髓鞘密度增加，并誘導(dǎo)M2巨噬細胞極化，進而改善神經(jīng)功能，而抑制內(nèi)皮細胞來源外泌體miRNA-126可顯著減弱內(nèi)皮細胞來源外泌體誘導(dǎo)的毛細血管形成和軸突生長[6]。提示內(nèi)皮細胞來源外泌體miRNA-126能調(diào)控血管和軸突生長，從而修復(fù)T2型糖尿病大鼠腦卒中損傷。

2.1.2 miRNA-145糖尿病患者伴隨著血管通透性的增加導(dǎo)致腦卒中的高發(fā)病率[15]，在糖尿病腦卒中大鼠中發(fā)現(xiàn)嚴重的白質(zhì)病變和軸突損傷[16-17]。在體外，與來自正常大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞（normal bone mesenchymal stem cells，NOR-BMSCs）組相比，來自糖尿病大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞（diabetes mouses-bone mesenchymal stem cells，DM-BMSCs）組的miRNA-145表達降低[18]。在體內(nèi)，DM-BMSC治療顯著改善血管和神經(jīng)元白質(zhì)重建，降低血清miRNA-145的表達，并增加miRNA-145靶點三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）和胰島 素樣生 長 因子1受 體（insulin-like growth fastor-1 receptor，IGF-1R）的表達，與NOR-BMSC治療相比，DM-BMSC治療卒中降低缺血邊緣區(qū)miRNA-145的表達，增加ABCA1和IGF-1R的表達，而miRNA-145+/DM-BMSCs顯著增加T1 DM-MCAO大鼠血清miRNA-145的表達，降低腦ABCA1和IGF-1R的表達，減弱DM-BMSC誘導(dǎo)的神經(jīng)修復(fù)作用[18]。上述結(jié)果提示miRNA-145/ABCA1/IGF-1R通路可能參與T1糖尿病卒中大鼠神經(jīng)修復(fù)作用。

2.1.3 miRNA-30d-5p腦卒中通常會引起神經(jīng)細胞的缺血缺氧，促進神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進而損害神經(jīng)組織[19]。研究證明腦卒中后的炎癥反應(yīng)在腦組織微環(huán)境的改變中起著重要作用[20]。大腦M2/M1小膠質(zhì)細胞比值的增加具有抗炎特性，并提供神經(jīng)保護作用。IL-4和IL-10是M2小膠質(zhì)細胞分泌的標志物，而腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶是M1小膠質(zhì)細胞分泌的標志物，在腦卒中患者和動物模型中注射ADSCs來源外泌體miRNA-30d-5p，TNF-α、IL-6和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達降低，而抗炎細胞因子IL-4和IL-10的表達增加。提示ADSC來源的外泌體miR-30d-5p通過抑制M1型小膠質(zhì)細胞極化來預(yù)防腦損傷和抑制炎癥反應(yīng)來減少缺血誘導(dǎo)的腦損傷[21]。

2.1.4 miRNA-133b Xin等[22]首次在大鼠腦卒中后全身注射MSC來源外泌體，與對照組相比，全身注射MSC來源外泌體顯著促進腦卒中大鼠的功能恢復(fù)，腦皮質(zhì)和紋狀體缺血邊緣區(qū)突觸素免疫陽性面積和軸突密度較對照組明顯增加。Xin等[23]深入研究發(fā)現(xiàn)MSC來源外泌體miRNA-133b能增強神經(jīng)可塑性和促進功能恢復(fù)，通過注射過表達miRNA-133b的MSC來源外泌體較單純MSC處理后，缺血邊界區(qū)特異性miRNA-133b靶點，如結(jié)締組織生長因子和Ras同源基因家族成員A（Ras homolog gene family member A，RhoA）的表達明顯降低，反之靜脈注射低表達miRNA-133b的MSC來源外泌體導(dǎo)致腦卒中大鼠軸突重塑和神經(jīng)功能減弱。在體外，皮層神經(jīng)元與miRNA-133b過表達的外泌體孵育可下調(diào)RhoA表達水平并促進軸突生長，miRNA-133b過表達的外泌體處理星形膠質(zhì)細胞則抑制結(jié)締組織生長因子的表達[22-23]。這些數(shù)據(jù)表明MSC來源外泌體miRNA-133b能夠調(diào)控RhoA基因表達，改善腦卒中大鼠神經(jīng)元軸突重塑和神經(jīng)功能恢復(fù)。

2.1.5 miRNA-124 miRNA-124在M2型小 膠質(zhì) 細胞BV2來源外泌體（M2-EXO）中表達增加。M2-EXO被神經(jīng)元攝取并進一步提高神經(jīng)元存活率，這一過程是由外泌體miRNA-124及其靶基因USP14介導(dǎo)。體外研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)神經(jīng)元時加入外泌體45 s后開始攝取M2-EXO。體內(nèi)研究表明，外泌體能夠穿越血腦屏障。在短暫大腦中動脈缺血后立即注射，第3天在大腦中檢測到的外泌體很少，并且每個區(qū)域的外泌體都不同[5]。然而，經(jīng)M2型小膠質(zhì)細胞來源外泌體miR-124治療后，可抑制泛素特異肽酶14（ubiquitin specific protease 14，USP14）的表達，抑制USP14可增強蛋白酶體活性，減少體外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞死亡[24]。提示miRNA-124通過靶向腦缺血后的USP14發(fā)揮神經(jīng)保護作用。提示外泌體miRNA-124通過靶向抑制腦缺血后的USP14表達和氧化應(yīng)激起到神經(jīng)修復(fù)作用。

2.1.6 miRNA-17-92體外研究表明miRNA-17-92過表達的MSC外泌體與對照組MSC外泌體相比，磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）蛋白表達水平增加促進胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元的軸突生長，但研究中沒有觀察到外泌體誘導(dǎo)的血管生成。體內(nèi)研究采用大鼠大腦中動脈閉塞模型，靜脈注射miRNA-17-92過表達的MSC外泌體，與對照組MSC外泌體相比，miRNA-17-92過表達的MSC外泌體增強神經(jīng)恢復(fù)，包括少突膠質(zhì)形成和軸突可塑性[25]。提示與單純的外泌體相比，過表達miRNA-17-92引起的外泌體含量變化可能有助于卒中后神經(jīng)可塑性的增強和神經(jīng)功能恢復(fù)，可能是通過影響靶細胞來實現(xiàn)。miRNA-17-92調(diào)控PTEN表達及其下游信號通路，影響蛋白激酶B、雷帕霉素蛋白和糖原合成酶激酶3β的磷酸化，可能是高表達miRNA-17-92的外泌體治療腦卒中的差異化療效的基礎(chǔ)。研究證明，在卒中后24 h開始治療，MSC和MSC外泌體治療不會改變腦梗死面積，但不能排除在卒中后24 h使用富含miRNA-17-92的MSC外泌體治療在缺血邊界區(qū)域也能起到保護神經(jīng)的可能性[25]。提示外泌體miRNA-17-92可能通過PTEN通路介導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)。

2.2 miRNAs在腦卒中的診斷作用

2.2.1 miRNA-30a-5p研究證實急性缺血性腦卒中患者血漿來源外泌體miRNA-30a-5p的表達水平在24 h、1周、4周、24周和48周均低于對照組，提示血漿來源外泌體miRNA-30a-5p的表達水平在急性腦缺血性卒中患者中顯著下降，但在6 h內(nèi)顯著上調(diào)[26]。上述結(jié)果提示血漿外泌體miRNA-30a-5p可能對急性腦缺血性卒中有診斷價值。

2.2.2 miRNA-98-3p人源神經(jīng)干細胞（human neural stem cells，hNSC）外泌體中的部分miRNAs與其細胞來源的外泌體不同，它們可能受到缺血環(huán)境變化的影響。從hNSCs中提取外泌體，并利用NGS分析hNSC來源的外泌體miRNA的表達譜，結(jié)果表明，在hNSC來源外泌體中檢測到差異表達的miRNAs，并且參與hNSC的外泌體對缺血免疫微環(huán)境有反應(yīng)，miRNA-98-3p被認為是一種特殊的hNSC來源的外泌體miRNA，在腦卒中動物模型中表達水平顯著下調(diào)[27]。提示外泌體miRNA-98-3p可能具有診斷腦卒中的作用。

2.3 mi-RNA在腦卒中的預(yù)后評估作用

2.3.1 miRNA-134體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中大鼠模型中miRNA-134的表達水平上調(diào)，缺血性卒中后軸突可塑性減弱[28]，體外研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-134的過表達顯著促進缺血缺氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[29]。收集急性缺血性腦卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者和正常對照組的血樣，從血樣中分離出外泌體，RT-qPCR分析顯示，急性缺血性腦卒中患者發(fā)病后24 h內(nèi)，血漿來源外泌體miRNA-134的表達高于對照組，但是卒中后24、48、72 h血漿來源外泌體miRNA-134水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），外泌體miRNA-134的表達變化與相對較早的時間段的關(guān)系有必要作進一步的研究，高表達的血漿來源外泌體miRNA-134與NIHSS評分、梗死體積呈正相關(guān)，并與腦卒中患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)，此外，miRNA-134與血清IL-6和血漿高敏C反應(yīng)蛋白的表達呈顯著正相關(guān)，ROC曲線提示miRNA-134可能是區(qū)分AIS患者和非卒中對照的一個潛在因素[30]。提示外泌體miRNA-134具有評估腦卒中預(yù)后的作用。

3 總結(jié)與展望

雖然外泌體治療腦卒中相關(guān)研究很多，但目前眾多問題仍待解決：①少數(shù)miRNAs在外泌體中的水平與來源細胞的關(guān)系。事實上，大約30%外泌體miRNAs與來源細胞中的miRNAs構(gòu)成不成比例，這表明miRNA不是隨機分布的，特定的miRNA被選擇運輸?shù)教囟ㄎh(huán)境[31]。②miRNAs是如何特異性地裝載到由來源細胞釋放的外泌體中。研究表明，將神經(jīng)元特異性狂犬病病毒糖蛋白肽融合到MSC來源的外泌體，結(jié)果顯示比未修飾的外泌體進一步促進神經(jīng)功能恢復(fù)。③外泌體注射的時間窗和組織窗。在大腦中動脈缺血性腦卒中后立即注射M2型巨噬細胞來源外泌體miRNA可以減輕缺血再灌注損傷，但在卒中后不同時間窗注射療效差異明顯，并且缺血邊緣區(qū)的外泌體miRNA的表達水平與缺血核心區(qū)有差異。④當前外泌體miRNA治療腦卒中的研究以實驗動物居多，臨床應(yīng)用較少，動物實驗結(jié)果與臨床實踐的差異性不容忽視。最后，外泌體miRNA在腦卒中的作用分子機制仍需更多深入研究，以期早日安全應(yīng)用。