CK- pan 免疫組織化學(xué)染色聯(lián)合彈力纖維染色時(shí)不同孵育方法對(duì)染色結(jié)果的影響

葉恩如 王教辰 翁壽向 鄭海紅

第八版國(guó)際肺癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤最大徑≤3 cm，周圍包繞肺組織及臟層胸膜，支氣管鏡檢查顯示腫瘤侵及葉支氣管，未侵及主支氣管為T1；腫瘤最大徑≤3 cm，凡是侵及臟層胸膜即為T2。TNM 分期與患者預(yù)后密切相關(guān)。目前認(rèn)為臟層胸膜由以下4 層構(gòu)成：間皮細(xì)胞層、間皮下結(jié)締組織層、彈力纖維層以及結(jié)締組織層。HE 染色時(shí)，彈力纖維層較難觀察，Elastin 染液可以使胸膜的彈力纖維染成藍(lán)黑色。但有些患者胸膜中斷裂、增生的彈力纖維較多，只有少量腫瘤細(xì)胞在彈力纖維層附近時(shí)，判讀腫瘤細(xì)胞是否突破彈力纖維層存在較大難度。CK-pan 免疫組織化學(xué)染色聯(lián)合彈力纖維染色（以下簡(jiǎn)稱雙重染色）時(shí)，腫瘤細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕色，彈力纖維呈藍(lán)黑色，對(duì)比明顯，能清楚顯示腫瘤細(xì)胞與彈力纖維層的關(guān)系。雙重染色結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)并可同步顯像胸膜及腫瘤細(xì)胞，能更好觀察腫瘤細(xì)胞與周圍胸膜之間的毗鄰關(guān)系，對(duì)于明確病理診斷及制定臨床治療方案具有積極意義[1]。溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院病理科常規(guī)操作雙重染色耗時(shí)約21.5 h，染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不能滿足臨床病理診斷時(shí)間的要求。筆者通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)比滴染Elastin 染液后，分別采用室溫過(guò)夜孵育（約18 h）、60 ℃烤箱孵育30 min、微波高檔加熱孵育60 s，發(fā)現(xiàn)60 ℃烤箱孵育對(duì)于提高雙重染色的染色質(zhì)量、縮短染色時(shí)間、節(jié)約試劑成本有積極意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 選取本院2018 年1 至3 月診斷為肺癌胸膜侵犯并符合質(zhì)控要求的30 例患者的病變組織蠟塊30 個(gè)，患者男18 例，女12 例，年齡51～69（60.00±3.56）歲；樣本類型為手術(shù)切除標(biāo)本。所有蠟塊均連續(xù)3 μm 切片3 張，各取1 張歸入A、B、C 組。用陽(yáng)離子玻片裱片，78 ℃烤片30 min。即用型CK-pan（鼠單抗AE1/AE3）購(gòu)自中國(guó)福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（批號(hào)：1907310049e）；二抗和DAB 均購(gòu)自中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：18101602）；即用型彈力纖維染色試劑盒購(gòu)自中國(guó)珠海貝索生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：619031）；液體封蓋膜購(gòu)自美國(guó)羅氏公司（批號(hào)：E31088）；油筆購(gòu)自中國(guó)基因科技股份有限公司。

1.2 CK-pan 免疫組織化學(xué)染色 全部切片脫蠟至水；加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（pH 9.0）95 ℃左右水煮修復(fù)15 min，PBS 沖洗3 min×3 次；加入3%過(guò)氧化氫5 min，蒸餾水洗；距組織5 mm 處用油筆畫線，蒸餾水洗，PBS沖洗3 min×3 次；滴加CK-pan 室溫孵育60 min，PBS沖洗3 min×3 次；滴加二抗室溫孵育15 min，PBS 沖洗3 min×3 次；滴加至DAB 顯色3 min，蒸餾水洗。

1.3 彈力纖維染色 按1.2 所述免疫組化染色后，所有切片加入95%乙醇溶液稍洗，快速用吸水紙擦干組織劃線兩側(cè)，滴加彈力纖維染色試劑盒的Elastin 染液。3組切片根據(jù)不同方法孵育：A 組室溫過(guò)夜孵育（約18 h）；B 組60 ℃烤箱孵育30 min；C 組覆蓋羅氏液體封蓋膜微波高檔孵育60 s。A、B、C 組切片加入95%乙醇溶液快速分化（鏡下觀察分化至彈力纖維組織清晰為止），自來(lái)水洗30 min，滴加Van Gieson 染液，室溫孵育1 min，傾去染液，95%乙醇溶液快速洗去多余染液，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 雙重染色評(píng)分 參考免疫組化和特殊染色質(zhì)量評(píng)分表，設(shè)計(jì)雙重染色質(zhì)量評(píng)分表。在本科室醫(yī)生中采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取2 位醫(yī)生針對(duì)染色質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分（總分10 分）：彈力纖維染色完整無(wú)缺失，腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性定位準(zhǔn)確，背景清晰無(wú)非特異性著色，這三方面單項(xiàng)最高分3 分，最低分0 分；無(wú)脫片1 分，脫片扣0～1 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組切片雙重染色情況比較 所有切片肺組織腫瘤細(xì)胞呈棕色，準(zhǔn)確定位于細(xì)胞質(zhì)，背景清晰，見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。A 組所有切片Elastin 染液均完全干涸；B 組中29 張切片Elastin 染液未干涸，僅稍有揮發(fā)，1 張切片Elastin 染液小部分干涸；C 組中28 張切片Elastin 染液均勻覆蓋，未見(jiàn)揮發(fā)，2 張切片Elastin 染液大部分干涸。A 組30 張切片均較難分化，整個(gè)背景非特異著色明顯；B 組29 張切片容易分化，背景干凈，1 張切片稍難分化，局部輕微背景著色；C 組28 張切片容易分化，背景干凈，2 張切片較難分化，出現(xiàn)較大范圍背景著色，見(jiàn)圖2（插頁(yè)）。

2.2 3 組切片雙重染色評(píng)分與染色總時(shí)間比較 A 組雙重染色評(píng)分（9.15±0.17）分，B 組（9.39±0.13）分，C 組（9.27±0.17）分，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A 組染色總時(shí)間（21.5 h）＞B 組染色總時(shí)間（4 h）＞C 組染色總時(shí)間（3.5 h）。

3 討論

馮耀等[2]研究發(fā)現(xiàn)臟層胸膜侵犯（VPI）1、3 和5 年的腫瘤患者從接受治療開始至發(fā)生任何原因死亡的時(shí)間（OS）均低于無(wú)VPI 組。雙重染色可直觀顯示腫瘤細(xì)胞是否侵犯胸膜彈力層。雙重染色包括免疫組織化學(xué)染色和彈力纖維染色，在臨床上免疫組織化學(xué)染色技術(shù)已經(jīng)十分成熟，因此雙重染色的重點(diǎn)是控制好彈力纖維染色關(guān)鍵染液Elastin 染液滴染孵育的溫度和時(shí)間，避免染液干涸，盡量使彈力纖維染色完整無(wú)缺失，背景清晰，無(wú)非特異性著色。

經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，A 組Elastin 染液室溫過(guò)夜孵育（約18 h），孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，染液干涸，較難分化，組織出現(xiàn)非特異著色，干擾染色結(jié)果判讀。B 組Elastin染液滴染60 ℃烤箱孵育30 min，少量揮發(fā)，試劑濃縮，彈力纖維的二硫鍵與Elastin 染液中間苯二酚的酚基在加熱時(shí)更易形成氫鍵而使彈力纖維被染成藍(lán)黑色[3]；B組1 張切片染液孵育過(guò)程中染液溢出劃線處，部分干涸，局部輕微背景著色，基本不影響診斷，將玻片劃線兩側(cè)盡量擦干，再滴加3～4 滴Elastin 染液可較好避免染液溢出劃線處。C 組覆蓋羅氏液體封蓋膜微波高檔孵育60 s，Elastin 染液處于羅氏液體封蓋膜下，不會(huì)揮發(fā)，微波能發(fā)射高頻能量，切片經(jīng)微波輻射后會(huì)加速在組織內(nèi)部的高速運(yùn)動(dòng)，加速組織的染色，同時(shí)還可縮短組織化學(xué)的染色[4]，彈力纖維染色快速高效完成；C 組孵育的缺點(diǎn)是Elastin 染液在微波作用下劇烈運(yùn)動(dòng)，有時(shí)羅氏液體封蓋膜和Elastin 染液會(huì)流出劃線區(qū)域，導(dǎo)致干片，切片被高溫破壞，彈力纖維著色不佳。

金蘇等[3]提出的雙重染色改良方案是用Rubber Cement 橡膠膠水將組織圈起來(lái)，滴加Elastin 染液于線圈內(nèi)，蓋上蓋玻片37 ℃孵育4 h，筆者的B 組改良染色方案比上述改良染色方案操作更便捷，染色時(shí)間更短。

綜上所述，B 組Elastin 染液干涸情況較少，染色結(jié)果穩(wěn)定，可降低VPI 疑難病例閱片難度，滴染成本低，操作簡(jiǎn)便，染色時(shí)間比傳統(tǒng)染色法縮短約17.5 h，提高了臨床對(duì)肺癌病理報(bào)告及時(shí)性和準(zhǔn)確性的滿意度，優(yōu)點(diǎn)較多。希望更多的病理工作者了解這個(gè)快捷高效的方法，并推廣應(yīng)用。