基因工程豬紅細(xì)胞替代人紅細(xì)胞治療貧血疾病的進(jìn)展

崔燁華　王毅

[摘要] 目前，血液制品短缺是一項世界性難題。其中，一些疾病如鐮刀型貧血等疾病需要反復(fù)輸注紅細(xì)胞治療，由此增加了患者發(fā)生致敏和溶血性輸血反應(yīng)等不良反應(yīng)，也更加限制了他們對供體血液的選擇范圍。為了解決這些問題，異種輸血是潛在的解決方案之一，而豬紅細(xì)胞（pRBCs）因?yàn)榕c人紅細(xì)胞具有多重相似性而受到廣泛的關(guān)注。然而，由于豬的紅細(xì)胞上天然存在3種已知的碳水化合物的異種抗原（半乳糖-α1，3-半乳糖[Gal]，N-羥乙酰神經(jīng)氨酸[Neu5Gc]，β-1，4-N-乙?；?半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶2[Sda]），單純的異種輸血是不可行的。最近，隨著基因工程豬技術(shù)的發(fā)展，已實(shí)現(xiàn)了敲除豬體內(nèi)特異性抗原的能力，以減少人類體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)的發(fā)生。該文主要總結(jié)了異種輸血的起源、最新研究進(jìn)展以及實(shí)現(xiàn)異種輸血需要克服的障礙等問題。

[關(guān)鍵詞] 紅細(xì)胞;異種輸血;豬紅細(xì)胞;基因工程

[中圖分類號] R556 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-0742（2020）11（a）-0196-03

Progress of Genetically Engineered Pig Red Blood Cells to Replace Human Red Blood Cells to Treat Anemia

CUI Ye-hua1， WANG Yi2

1.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Nanhua University， Hengyang， Hunan Province， 421001 China; 2.Department of Urology， Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College， Haikou， Hainan Province， 570311 China

[Abstract] At present， the shortage of blood products is a worldwide problem. Among them， some diseases， such as sickle-type anemia， require repeated red blood cell transfusion， which increases the patient's adverse reactions such as sensitization and hemolytic transfusion reactions， and also limits their choice of donor blood. To solve these problems， heterologous blood transfusion is one of the potential solutions， and porcine red blood cells （pRBCs） have received widespread attention because of their multiple similarities with human red blood cells. However， due to the natural existence of three known carbohydrate heterologous antigens （galactose-α1，3-galactose [Gal]， N-glycolylneuraminic acid [Neu5Gc]， β-1，4-N-acetyl-galactosaminyl transferase 2 [Sda]）， pure heterogeneous blood transfusion is not feasible. Recently， with the development of genetically engineered pig technology， the ability to knock out specific antigens in pigs has been achieved to reduce the occurrence of human humoral and cellular immune responses. This article mainly summarizes the origin of heterogeneous blood transfusion， the latest research progress， and the obstacles that need to be overcome to achieve heterogeneous blood transfusion.

[Key words] Red blood cells;Heterologous blood transfusion;Pig red blood cells;Genetic engineering

紅細(xì)胞血液制品在急救復(fù)蘇、大型危重手術(shù)和慢性血液疾病上的治療可謂是重中之重，但隨著對血液需求量的上升，血液制品的供需平衡遭到了破壞，各大醫(yī)院以及輸血中心經(jīng)常會出現(xiàn)供不應(yīng)求的情況，用血緊張是目前臨床上公認(rèn)的問題。近幾年來，尋找新的血液制品替代品已成為熱門的研究方向，由于種種原因，例如后代的數(shù)量、器官的大小以及與人類的功能相似性，豬被認(rèn)為是跨物種移植（異種移植）或輸血（異種輸血）的最佳器官和細(xì)胞來源而受到了廣泛的關(guān)注。該綜述涵蓋了2011年5月—2020年4月世界范圍內(nèi)14篇關(guān)于異種紅細(xì)胞輸注的研究文章，從豬紅細(xì)胞所具備的優(yōu)點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)動物模型的選擇以及異種紅細(xì)胞輸注所面臨困難的幾個方面，淺要地分析了基因工程豬紅細(xì)胞作為新型血液制品替代品的可行性，為解決世界范圍內(nèi)紅細(xì)胞短缺的問題提供了新的思路。

1 ?介紹

1.1 ?異種輸血的起源

使用非人類動物血液制品替代人血液制品治療可追溯到1667年，且一直持續(xù)到20世紀(jì)初，早期的異種輸血血液制品為異種來源，1665年Richard Low僅使用兩只狗進(jìn)行了最初的動物紅細(xì)胞輸注的實(shí)驗(yàn)研究。而第一次用于人類身上的異種輸血發(fā)生在1667年，當(dāng)時法國路易十四國王的醫(yī)生將一只羔羊的血液輸入至一名高燒的年輕男子身上，隨后患者出現(xiàn)了反復(fù)的流血現(xiàn)象[1]，在現(xiàn)代稱這種現(xiàn)象叫做急性溶血反應(yīng)。

1.2 ?血液的供應(yīng)、需求及安全

根據(jù)WHO世界衛(wèi)生組織的最新報告，每年可以收集大約1.12億獻(xiàn)血者的血液，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了全球血液的需求量，其中又以O(shè)型血的短缺最為嚴(yán)重[2]。而在人類免疫缺陷病毒（HIV）高發(fā)的國家，血液制品短缺的情況就越發(fā)嚴(yán)峻。同時對于需要反復(fù)接受紅細(xì)胞輸注治療的患者（如鐮刀型貧血等）而言，長期的慢性輸血史使其體內(nèi)具有遠(yuǎn)高于一般健康人表達(dá)水平的同種異型免疫抗體，其原因可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)鐮刀型貧血（SCD）患者是非洲裔美國人，他們絕大多數(shù)的RH血型表型為RH D+C-E-c+e+，但由于大多數(shù)捐血者是美國白人，只有不到2%的美國白人RH血型與之相同[3]。因此，尋找新的血液制品替代品已成為亟待解決的問題。

1.3 ?豬紅細(xì)胞作為一種新的血液替代品

鑒于上述種種問題，人類紅細(xì)胞血液制品的新型替代品引起了高度關(guān)注，其中豬作為異種器官移植及異種輸血的供體受到的關(guān)注度最高。豬作為異種輸血的供體有以下幾個優(yōu)點(diǎn)：①豬紅細(xì)胞的平均壽命稍短于人紅細(xì)胞（豬紅細(xì)胞平均89 d，人紅細(xì)胞平均120 d），但二者紅細(xì)胞的直徑和計數(shù)差別不大;②豬與人血紅蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)，豬的血型系統(tǒng)是AO（H）系統(tǒng)，和人類的ABO系統(tǒng)亦松散相關(guān)聯(lián)， 而且許多“次要”血型抗原（例如Kell血型抗原）似乎沒有在豬紅細(xì)胞表面上表達(dá)[4];③豬在無菌環(huán)境下相對容易繁殖和成熟，其高繁殖能力提供了取之不盡，用之不竭紅細(xì)胞;④相關(guān)報道表明[1]豬基本上沒有對人類有致病性的細(xì)菌、真菌和寄生蟲，雖然豬器官可能存在異種逆轉(zhuǎn)錄病毒引入人體的風(fēng)險，但由于成熟的紅細(xì)胞并沒有細(xì)胞核，所以規(guī)避了該風(fēng)險。根據(jù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)報告[5]，通過必要的篩查方案和豬群必須的生物安全性住房檢查，與人類捐贈者相比，豬異種移植傳播傳染病的風(fēng)險要低許多。綜上所述，豬紅細(xì)胞可能是作為人類紅細(xì)胞血液制品替代品進(jìn)行異種輸血的最優(yōu)選擇。

2 ?免疫障礙

想真正將豬紅細(xì)胞（pRBC）用于臨床輸血之前，首當(dāng)其沖需要解決的問題是免疫學(xué)問題。野生豬身上天然存在Gal、Neu5Gc和 Sda 3種異種抗原，而人類細(xì)胞表面并沒有表達(dá)這3類抗原，所以血清中存在3者的天然抗體，舊世界非人類靈長類動物（OWNHP）如狒狒的紅細(xì)胞只存在Neu5Gc抗原，不存在Gal和Sda抗原，所以和人類一樣，血清中天然表達(dá)Gal以及Sda抗體[6]。如果將野生型的pRBCs輸入靈長類動物體內(nèi)，則會因?yàn)橐吧i天然存在的3種異種抗原（Gal， Neu5Gc 和 Sda），立即引起抗原抗體結(jié)合，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)排斥反應(yīng)。其中Gal是末端上的寡糖結(jié)構(gòu)，是靈長類動物抗體的主要靶抗原，故將存在Gal抗原的豬紅細(xì)胞、組織和器官作為供體移植給人類或NHP（非人靈長類動物），會迅速激活補(bǔ)體，導(dǎo)致快速炎癥反應(yīng)和凝血功能失調(diào)，使細(xì)胞損傷裂解并死亡，加速HAR（超急性排斥反應(yīng)）的發(fā)生。HAR會導(dǎo)致移植物被迅速清除，類似于人類ABO血型不相容的結(jié)果[7-8]。除此之外，人類有另外2種天然存在的抗體（Neu5Gc和 Sda），盡管細(xì)胞毒性較抗Gal抗體小，卻能在體外快速啟動補(bǔ)體介導(dǎo)的豬細(xì)胞裂解反應(yīng)和NPH對豬器官的異種排斥反應(yīng)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)室使用GTKO（Gal基因敲除）供體的器官消除了Gal抗體介導(dǎo)的異種移植物排斥反應(yīng)，卻依然沒有消除其他異種抗原介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，強(qiáng)調(diào)了其他異種抗原對異種移植的重要性和關(guān)聯(lián)性[9]。

3 ?TKO基因工程豬的獲得與前景

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，獲得3種異種抗原基因均敲除（TKO）的豬成為可能。如果要將pRBC成功輸入人體， TKO豬可能是更好的選擇。流式細(xì)胞儀分析顯示，每敲除一個異種抗原基因，其血清抗原抗體結(jié)合水平就隨之降低。當(dāng)使用GTKO、Gal/Neu5Gc抗原敲除以及 TKO豬的RBCs和PBMC（外周血單核細(xì)胞）分別與人類血清相結(jié)合時，TKO的豬與人血清的IgM（免疫球蛋白M）及IgG（免疫球蛋白G）抗體結(jié)合比率遠(yuǎn)低于GTKO pRBC與人血清結(jié)合的比率，并且和人ABO血型相容（陰性對照組）的結(jié)合結(jié)果差異并不明顯[10-11]。這表明具有更低的抗原抗體結(jié)合水平TKO豬是更好供體的選擇，相關(guān)實(shí)驗(yàn)報道同樣證實(shí)了TKO基因豬是人類生物人工心臟瓣膜理想的替代品[12]。未來異種移植的動物研究模型，應(yīng)該要基于具有低水平抗體結(jié)合和水平的TKO豬作為背景，調(diào)節(jié)補(bǔ)體和抗凝血機(jī)制，以最大限度延長移植物的存活時間。

4 ?TKO豬異種實(shí)驗(yàn)的非人靈長類動物模型選擇研究

目前，狒狒或者其他OWNHP已被確定為異種移植模型中的可靠宿主，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)與人類相似的蛋白質(zhì)，但舊世界猴子仍然在一個重要方面和人類不同，即它們表達(dá)Neu5Gc抗原（人類不表達(dá)），因此不產(chǎn)生抗Neu5Gc抗體，所以舊世界猴對于研究Gal以及Sda抗原是一個合適的模型，但它們不適合用于研究表達(dá)（或不表達(dá)）豬Neu5Gc的模型。當(dāng)使用TKO豬作為供體，會發(fā)現(xiàn)TKO豬與狒狒血清的抗體結(jié)合水平遠(yuǎn)高于TKO豬與人類血清的結(jié)合水平，與TKO豬低水平抗體的實(shí)驗(yàn)預(yù)期不相符。究其原因可能是在未知第4種抗原在敲除3種基因后得到了表達(dá)并與狒狒血清中的未知抗體結(jié)合，而人類并沒有此類抗體[13]。所以使用狒狒作為TKO豬移植受體時，可能很難得到實(shí)驗(yàn)預(yù)期的結(jié)果。而卷尾猴（capuchin）這類NWHNP（新世界非人靈長類動物）在紅細(xì)胞上完全和人類一樣不表達(dá)Gal、Neu5Gc和Sda[6]，更加貼近人類異種抗原表達(dá)情況。受限于卷尾猴體型等其他原因，缺乏作為大型異種器官移植動物模型的經(jīng)驗(yàn)，但對于組織以及紅細(xì)胞異種移植，尤其是TKO基因型豬作為供體時，卷尾猴更加優(yōu)于狒狒及其他舊世界猴子模型，是更理想的動物實(shí)驗(yàn)研究模型。

5 ?結(jié)論

尋找新的紅細(xì)胞血液替代制品是解決全世界血液供應(yīng)短缺最有效的辦法之一，目前新的血液替代制品的研究主要為兩條發(fā)展思路，分別是尋找及研發(fā)血紅蛋白類攜氧載體以及使用異種來源的紅細(xì)胞，而異種輸血所面臨的問題則主要是由天然的異種抗原抗體所介導(dǎo)的免疫排斥反應(yīng)。隨著近幾年基因工程技術(shù)的發(fā)展，使得通過基因敲除技術(shù)培育出細(xì)胞表面天然不表達(dá)異種抗原（Gal、Neu5Gc、Sda）的豬成為可能，即我們常說的TKO豬（三重基因敲除豬）。因?yàn)門KO豬紅細(xì)胞具有與人類血清極低的抗原抗體結(jié)合率[10-11]，使得TKO 豬紅細(xì)胞作為新型紅細(xì)胞血液制品的理想選擇而受到人們廣泛的關(guān)注，特別是對輸血有著嚴(yán)格限制以及長期需要進(jìn)行紅細(xì)胞輸注治療的慢性疾病患者而言，由于豬紅細(xì)胞表面不會表達(dá)次要血型抗原，以及可通過基因工程人為地選擇敲除掉豬紅細(xì)胞主要抗原[4]，豬紅細(xì)胞比起普通血液制品可以更有效地降低慢性血液疾病患者中同種免疫的發(fā)生率，以減少溶血反應(yīng)，對于某些疾病來說豬紅細(xì)胞可能是更好的選擇。但狒狒這類舊世界猴由于細(xì)胞表面天然表達(dá)Neu5Gc抗原（人類不表達(dá)），所以并不適合作為研究表達(dá)（或不表達(dá)）豬Neu5Gc的動物模型。為此選擇使用與人類紅細(xì)胞抗原表達(dá)更為接近的卷尾猴（即紅細(xì)胞表面天然不表達(dá)Gal、Neu5Gc和Sda）可能是更好的選擇[6]，當(dāng)使用TKO豬作為紅細(xì)胞供體時，卷尾猴比起狒狒更加適合作為異種紅細(xì)胞輸注的移植受體。但在真正實(shí)行豬異種紅細(xì)胞輸注的初步臨床試驗(yàn)之前，依然存在一些不足需要進(jìn)一步完善，如證明豬紅細(xì)胞完全沒有人畜共患病;證明使用過豬紅細(xì)胞血液制品的人不會影響將來人與人同種之間的輸血;明確血液等滲性的微小差異等因素是否會影響豬紅細(xì)胞的存活率;確定豬紅細(xì)胞存儲的最佳時間和最佳條件;以及一些倫理及地域文化問題。但我們相信，在不久的將來，豬紅細(xì)胞會被進(jìn)一步證明是人類紅細(xì)胞新型血液制品的替代品中較好的選擇。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?Smood B， Hara H， Schoel LJ， et al. Genetically-engineered pigs as sources for clinical red blood cell transfusion： What pathobiological barriers need to be overcome[J].Blood Rev， 2019， 35：7-17.

[2] ?Ellingson KD，Sapiano MRP， Haass KA， et al. Continued decline in blood collection and transfusion in the United States-2015[J].Transfusion，2017，57：1588-1598.

[3] ?Yazdanbakhsh K. How I safely transfuse patients with sickle cell disease and manage delayed hemolytic transfusion reactions[J]. Blood， 2018，131（25）：2773-2781.

[4] ?Yee MEM， Josephson CD， Winkler AM，et al. Red blood cell minor antigen mismatches during chronic transfusion therapy for sickle cell anemia[J].Transfusion，2017，57（11）：2738-2746.

[5] ?Fishman JA.Infectious disease risks in xenotransplantation[J].American Journal of Transplantation，2018，18（8）：1857-1864.

[6] ?Li Q， Shaikh S， Iwase H， et al. Carbohydrate antigen expression and anti-pig antibodies in New World capuchin monkeys： Relevance to studies of xenotransplantation[J].Xenotransplantation，2019， 26（3）：e12498.

[7] ?Lu T， Yang B， Wang R， et al. Xenotransplantation： Current Status in Preclinical Research[J].Front Immunol，2019，10：3060.

[8] ?Cooper DK， Ekser B， Ramsoondar J，et al. The role of genetically engineered pigs in xenotransplantation research [J].J Pathol， 2016， 238（2）： 288-299.

[9] ?Tazelaar HD， Byrne GW， Mcgregor CG. Comparison of Gal and non-Gal-mediated cardiac xenograft rejection [J].Transplantation，2011，91（9）：968-975.

[10] ?Wang ZY，Martens GR，Blankenship RL，et al. Eliminating Xen oantigen Expression on Swine RBC[J].Transplantation， 2017， 101（3）：517-523.

[11] ?Lu Q，Hara H，Banks CA， et al.Anti-Pig Antibody in Infants： Can a Genetically Engineered Pig Heart Bridge to Allotrans plantation[J].The Annals of Thoracic Surgery，2020，109（4）：1268-1273.

[12] ?Zhang R， Wang Y， Chen L，et al.Reducing immunoreactivity of porcine bioprosthetic heart valves by genetically-deleting three major glycan antigens， GGTA1/β4GalNT2/CMAH[J]. Acta Biomaterialia，2018，72：196-205.

[13] ?Cooper DKC， Ezzelarab MB，Hara H. Low anti-pig antibody levels are key to the success of solid organ xenotransp lantation：But is this sufficient[J].Xenotrans Plantation，2017， 24（6）：e12360.

（收稿日期：2020-08-09）

[作者簡介] 崔燁華（1992-），男，碩士在讀，研究方向?yàn)楫惙N移植。

[通信作者] 王毅（1964-），男，博士，教授，研究方向?yàn)楫惙N移植，E-mail：wayne0108@126.com。