不同產(chǎn)地及炮制方法雪上一枝蒿中雪上一枝蒿甲素含量對(duì)比研究*

牛延菲，曹紅云，徐 怡，張曉南，王 鵬，蘇 鈦

(1 西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650224；2 云南省藥物研究所，云南 昆明 650111)

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄烏頭的干燥塊根(拉丁名：AconitumbrachypodumDiels.)[1]。其味苦、辛，性溫，有大毒[1]，主產(chǎn)于云南北部的東川、會(huì)澤等地，具有祛風(fēng)鎮(zhèn)痛的功效，用于治療風(fēng)濕疼痛、跌打損傷等癥[2]。其化學(xué)成份包括生物堿和非生物堿兩大類[3-4]，其生物堿成分主要為二萜類生物堿[5-8]，國內(nèi)外學(xué)者[9-14]對(duì)雪上一枝蒿中生物堿成分進(jìn)行了充分研究，發(fā)現(xiàn)了包括烏頭堿、雪上一枝蒿甲素等在內(nèi)的數(shù)十種生物堿；王洪云[4]、楊立國等[12]發(fā)現(xiàn)其非生物堿類成分有：β-谷甾醇、胡蘿卜苷、多糖等其他成分。現(xiàn)代藥理試驗(yàn)表明[15-17]，雪上一枝蒿具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎以及局部麻醉的藥理作用，另外還有抗生育[18]、抑制呼吸系統(tǒng)興奮的作用。

雪上一枝蒿為大毒藥材，《云南中藥志》言其：“本品有毒，未經(jīng)炮制，不宜內(nèi)服?！陛^準(zhǔn)確地記載了其毒性。烏頭類中藥材毒性較強(qiáng)，須經(jīng)炮制后入藥。炮制后，烏頭類中藥材中的雙酯型烏頭堿會(huì)水解成毒性較小的單酯型烏頭堿[5]，雪上一枝蒿除含有烏頭堿等雙酯型生物堿外，雪上一枝蒿甲素亦是其主要化學(xué)成分，目前鮮有雪上一枝蒿炮制前后雪上一枝蒿甲素含量測定的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

雪上一枝蒿甲素為二萜生物堿，作為雪上一枝蒿的主要活性成分，能夠抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗心律失常、強(qiáng)心、抗生育[19-21]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，雪上一枝蒿甲素為醇胺型二萜生物堿。為考察雪上一枝蒿甲素受地理因素和炮制方法的影響程度，在建立準(zhǔn)確可行的測定方法基礎(chǔ)上，對(duì)不同產(chǎn)地和不同炮制方式的雪上一枝蒿甲素含量進(jìn)行測定和分析。此方法的開發(fā)，可為雪上一枝蒿的炮制工藝及飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供更加有利的依據(jù)和參考價(jià)值。

1 儀器與材料

美國Agilent 1100高效液相色譜儀：四元泵；DAD檢測器；自動(dòng)進(jìn)樣器；在線真空脫氣機(jī)；智能化柱溫箱及Agilent化學(xué)工作站；DHG-9037A電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多；AG285型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；SK250HP超聲儀，上?？茖?dǎo)。

雪上一枝蒿甲素(批號(hào)：110895-200404，純度以100%計(jì))，購自中國食品藥品檢定研究院；色譜甲醇(批號(hào)：JA025830，色譜純)，德國默克；氨水，甲醇，三氯甲烷，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀均為分析純。

雪上一枝蒿藥材采自云南東川、會(huì)澤、麗江，由云南省研究所正高級(jí)工程師高麗鑒定為毛茛科植物短柄烏頭的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xterra C18柱(5 μm，4.6×250 mm)；流動(dòng)相：pH 7.3磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，按表1洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密取甲素對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

取本品粉末1.5 g，精密稱定，置150 mL錐形瓶中，加1 mL氨試液，再精確移入50 mL三氯甲烷，回流2小時(shí)(80 ℃)，放至室溫，用快速濾紙過濾，殘?jiān)礈?次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓蒸干(40 ℃以下)，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?5 mL量瓶，混勻后，濾過，即得。

2.1.4 專屬性與系統(tǒng)適用性

取供試品溶液和對(duì)照品溶液，同時(shí)準(zhǔn)備空白溶液和加標(biāo)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果見圖1。由圖1可以看出供試品溶液與對(duì)照品溶液中雪上一枝蒿甲素在相同位置出峰，且空白溶液對(duì)含量測定無干擾，色譜峰的理論塔板數(shù)，分離度，對(duì)稱因子均符合要求，表明本法具有良好的專屬性和系統(tǒng)適用性。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC圖譜

2.1.5 線性關(guān)系

精密稱取雪上一枝蒿甲素對(duì)照品適量(10.30 mg)，置25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，即得每1 mL含0.1030 mg的儲(chǔ)備液。精密吸取該儲(chǔ)備液，逐級(jí)稀釋，稀釋濃度見表2，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以含量(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=674.37X+13.588，r =0.9999。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，雪上一枝蒿甲素在0.0515～10.3000 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.6 儀器精密度

取同一對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD值為0.5%(n=6)，結(jié)果表明儀器具有良好的精密度。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取飲片6份，按供試品制備方法制備，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。記錄峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，RSD值為0.7%(n=6)，結(jié)果表明本法的重復(fù)性較好。

2.1.8 檢測限和定量限試驗(yàn)

取“2.1.5”項(xiàng)下雪上一枝蒿甲素對(duì)照品溶液適量，以甲醇稀釋配制成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，分別以3倍和10倍信噪比作為指標(biāo)，考察檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果檢測限為0.02575 μg，定量限為0.0515 μg。

2.1.9 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密取雪上一枝蒿甲素對(duì)照品適量(26.00 mg)，置入25 mL量瓶，加10 mL甲醇溶解后，用甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含1.04 mg的溶液，即得。

精密稱取9份供試品(已知含量為0.2859%)，每份約0.75 g，分別加上述對(duì)照品溶液1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2 mL、2 mL、3 mL、3 mL、3 mL，然后按供試品制備方法制備，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3，回收率在93.57%～100.55%之間，RSD值為3.0%(n=9)，回收率良好。

表3 加樣回收試驗(yàn)

2.1.10 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)溶液穩(wěn)定性做了考察，取制備好的供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)分別于0、2、6、8、16、24小時(shí)進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算，RSD值為2.9%(n=6)，說明樣品在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 樣品測定

2.2.1 不同產(chǎn)地藥材含量測定

取不同產(chǎn)地的15批藥材，按“2.1.3”項(xiàng)制備，按“2.1.1”項(xiàng)測定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，云南東川、會(huì)澤、麗江產(chǎn)區(qū)的雪上一枝蒿甲素含量在0.09%～0.33%之間，不同產(chǎn)地不同批次藥材雪上一枝蒿甲素含量存在一定差異。

表4 15批樣品測定結(jié)果

2.2.2 不同炮制方式含量測定

雪上一枝蒿為大毒藥材，《云南中藥志》言其：“本品有毒，未經(jīng)炮制，不宜內(nèi)服?！陛^準(zhǔn)確地記載了其毒性。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)其炮制進(jìn)行了大量研究，江林等對(duì)不同產(chǎn)地和不同炮制方法的雪上一枝蒿的總堿含量作了實(shí)驗(yàn)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)水煮是最優(yōu)的炮制方式。在實(shí)際生產(chǎn)中，考慮到安全和提取效果，多在投料前進(jìn)行蒸煮炙，雪上一枝蒿藥材中含有大量的雙酯型生物堿，在進(jìn)行蒸煮炙時(shí)，會(huì)轉(zhuǎn)變成單酯型生物堿，以達(dá)到減毒增效的目的。

為考察不同炮制方式對(duì)雪上一枝蒿甲素含量的影響，對(duì)藥材進(jìn)行蒸(蒸至透心)、煮(煮至透心)、高壓(121 ℃炮制15 min)炮制，使用不同溫度(50 ℃、60 ℃、75 ℃、100 ℃、130 ℃、150 ℃)進(jìn)行干燥，得18批雪上一枝蒿飲片，使用經(jīng)驗(yàn)證的方法測定雪上一枝蒿甲素含量。

檢測結(jié)果見表5。根據(jù)檢測結(jié)果炮制前后含量變化不顯著，說明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工藝影響，該結(jié)論與其化學(xué)性質(zhì)相吻合(醇胺型二萜生物堿，無酯基，不易水解)。

表5 不同炮制方法含量測定結(jié)果

3 結(jié) 論

雪上一枝蒿中主要化學(xué)成分為二萜生物堿，也是其毒性成分，生物堿在煎煮后毒性也會(huì)顯著變小，其過程為烏頭堿在煎煮條件下可水解生成毒性更小的次烏頭堿，若繼續(xù)煎煮次烏頭堿可進(jìn)一步發(fā)生水解成具有更小毒性的烏頭原堿。雪上一枝蒿甲素屬于二萜生物堿，能夠抗炎鎮(zhèn)痛，為雪上一枝蒿的主要活性成分。目前，全國沒有統(tǒng)一的雪上一枝蒿炮制規(guī)范工藝，為考察雪上一枝蒿甲素是否會(huì)受到地理因素和炮制方法的影響，研究建立了準(zhǔn)確可行的飲片中雪上一枝蒿甲素測定方法，比較了云南東川、會(huì)澤、麗江三個(gè)產(chǎn)區(qū)的藥材含量差異，同時(shí)考察民間常用的炮制方式對(duì)其含量的影響。

研究結(jié)果表明，所建立的雪上一枝蒿甲素的測定方法，專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測限及耐用性均符合規(guī)定，易操作，準(zhǔn)確度高；使用經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證的檢測方法，對(duì)采自云南東川、會(huì)澤、麗江的不同批次藥材進(jìn)行了甲素含量測定，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地不同批次藥材中的雪上一枝蒿甲素含量存在一定差異；考察了蒸、煮、高壓炮制后不同溫度干燥的雪上一枝蒿甲素含量變化，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，不同炮制方式雪上一枝蒿甲素?zé)o顯著變化，說明雪上一枝蒿甲素不易受炮制工藝影響，該結(jié)論與其化學(xué)性質(zhì)相吻合(醇胺型二萜生物堿，無酯基，不易水解)。