制作簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱建立小鼠哮喘模型研究?

田 丹 許虎峰

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心 北京市臨床醫(yī)學(xué)研究所 移植耐受與器官保護(hù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 王松靈院士口腔與全身健康免疫研究實(shí)驗(yàn)室 北京 100050)

哮喘在全世界的發(fā)病率正在逐步上升,目前已經(jīng)成為全球人類(lèi)健康的巨大威脅[1]。霧化吸入給藥是臨床治療呼吸道相關(guān)疾病的重要治療手段,也是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行呼吸道相關(guān)疾病研究的重要實(shí)驗(yàn)方法[2]。目前越來(lái)越多的醫(yī)療廠商開(kāi)發(fā)出小巧高效的藥物霧化吸入儀器用于各種呼吸道患者的居家給藥。相對(duì)家用型霧化器,用于動(dòng)物研究的特制霧化箱可選型號(hào)少、價(jià)格偏高且便攜性偏低。因此,應(yīng)用簡(jiǎn)單易操作的方法將家用型醫(yī)療霧化吸入裝置改造為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱將為呼吸道疾病的順利研究提供便利。

本研究將利用家用霧化器和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的獨(dú)立通氣鼠籠改造為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用霧化箱,并進(jìn)行小鼠過(guò)敏性哮喘造模。結(jié)合家用霧化器易得與價(jià)格低廉的特點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)室已有條件以低成本制成動(dòng)物呼吸道相關(guān)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定模型。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱制作與使用

1.1 制作材料

空氣壓縮式霧化器(魚(yú)躍醫(yī)療,型號(hào)403M)、橡皮筋、獨(dú)立通氣鼠籠(弘騰生物科技,型號(hào)9085D-64)

1.2 制作方法

清空鼠籠,取下鼠糧槽和鼠籠蓋,由外向內(nèi)推進(jìn)鼠籠蓋通氣閥并摘下固定橡膠圈,拆卸下鼠籠通氣口的彈簧和單向通氣閥(僅拆卸其中一個(gè)通氣閥即可)。摘下家用霧化器霧化杯上的面罩,將橡皮筋纏繞并套在霧化杯出口,保持適度松緊。將霧化杯旋轉(zhuǎn)插入鼠籠通氣閥的接口中,保持穩(wěn)定。將霧化杯通過(guò)軟管連接上霧化器(圖1、圖2)。

1.3 使用方法

霧化杯中加入不超過(guò)8 m L需要霧化的液體,將霧化杯蓋緊杯蓋。開(kāi)啟電源霧化后即可見(jiàn)白霧從通氣口噴入霧化箱,持續(xù)霧化半分鐘后霧化氣體即可充滿整個(gè)小鼠鼠籠。每個(gè)霧化箱同時(shí)可給1～20只小鼠進(jìn)行霧化處L,8 m L霧化液體可持續(xù)霧化至少30 min。

2 利用自制霧化箱進(jìn)行小鼠過(guò)敏性哮喘造模

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

圖1 制作簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱所需要的的材料注:A.制作簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱的主要材料;B.制作霧化箱需要的家用霧化器配套的霧化杯(出霧口直徑2.3 cm);C.制作霧化箱需要的小鼠籠蓋(通氣口內(nèi)徑2.7 cm);① 家用霧化器主機(jī);② 家用霧化器配套的霧化杯;③ 橡皮筋;④ 獨(dú)立通氣鼠籠;⑤ 通氣口上拆卸下來(lái)的通氣閥;⑥ 通氣閥上的固定橡膠圈;⑦安裝上通氣閥的鼠籠通氣口;⑧ 卸下通氣閥的鼠籠通氣口;⑨獨(dú)立通氣鼠籠蓋上的空氣過(guò)濾Fig.1 The materials used to manufacture the experimental animal atomization boxNote:A The materials used to manufacture the experimental animal atomization box;B atomization cup(outlet diameter:2.3 cm);C atomization box cover (outlet diameter:2.7 cm);①household medical atomizer;②atomization cup of household medical atomizer;③rubber band;④individually ventilated cage;⑤vent valve of mouse cage;⑥r(nóng)ubber ring of vent valve;⑦cage outlet blocked with vent valve;⑧cage outlet unblocked with vent valve;⑨air filtration window on cage cover

圖2 組裝完畢的霧化箱注:圖中藍(lán)色箭頭表示開(kāi)啟霧化后的霧化氣流方向Fig.2 Assembled atomization boxNote:The blue arrow shows the direction of automization plow

6～8周齡雄性 C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-001。在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院動(dòng)物倫L委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào):12-2001)。其他相關(guān)試劑:雞卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,Sigma公司,貨號(hào)A2512,純度≥98%,用于腹腔注射;貨號(hào) A5378,純度≥90%,用于霧化吸入),ImjectTMAlum鋁佐劑(Thermo公司,貨號(hào)77161),磷酸緩沖液(Corning公司,貨號(hào)21-031-CVR)。

2.2 哮喘造模方法

取6～8周齡雄性C57BL/6小鼠,在第0天和第14天進(jìn)行腹腔注射20μg OVA蛋白免疫原(體積100μL,含 50μL ImjectTMAlum鋁佐劑和50μL磷酸緩沖液),對(duì)照組小鼠僅注射100μL磷酸緩沖液。從第28天開(kāi)始,連續(xù)3 d應(yīng)用自制霧化箱對(duì)兩組小鼠進(jìn)行霧化1%OVA吸入,每次吸入30 m in。 在第32天,處死小鼠,取小鼠肺組織,進(jìn)行石蠟包埋、切片和蘇木精-伊紅染色[3]。

2.3 造模效果檢測(cè)

將小鼠肺組織進(jìn)行4%甲醛固定、石蠟包埋固定和切片,之后對(duì)切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。如圖3所示,與僅進(jìn)行1%OVA吸入的小鼠相比,進(jìn)行2次OVA免疫和3次1%OVA吸入后,小鼠肺臟支氣管壁明顯增厚,肺組織產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),表明成功建立了OVA誘導(dǎo)的小鼠過(guò)敏性哮喘模型。

圖3 利用自制霧化箱建立小鼠過(guò)敏性哮喘模型注:A.小鼠過(guò)敏性哮喘造模過(guò)程流程圖;B.僅接收霧化吸入 OVA的小鼠肺臟;C.進(jìn)行腹腔注射OVA蛋白和霧化Fig.3 Build the mouse allergic asthma model with self-designed atomization boxNote:A.Schematic representation of the mouse allergic asthma procedure;B.The mouse was only inhaled with OVA;C.The allergic asthma mouse was vaccinated with OVA intraperitoneally and inhaled with OV

3 討論

本自制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱主要成本來(lái)自家用霧化器,市場(chǎng)售價(jià)不到300元,成本低廉,購(gòu)買(mǎi)方便。該霧化器產(chǎn)生的霧化顆粒大小為3.9μm,5μm以下顆粒占比大于65%,能將霧化藥物充分運(yùn)送至肺部支氣管[4]。霧化氣流量可達(dá) 10 L/min,最大霧化率≥0.2 m L/m in完全滿足了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的霧化需求。

除了主要部件霧化器外,本模型中還應(yīng)用到了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中廣泛使用的獨(dú)立通氣鼠籠。該型號(hào)鼠籠的通氣口內(nèi)徑略大于霧化杯外徑,因此便于研究人員通過(guò)簡(jiǎn)單的橡皮筋連接霧化杯和鼠籠并成功改造成為霧化箱。該型號(hào)鼠籠由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易得和拆卸方便,大量應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,并且在霧化吸入實(shí)驗(yàn)完成后可以重新組裝為動(dòng)物飼養(yǎng)籠具。本制作方法也利用了該鼠籠拆卸簡(jiǎn)便的特點(diǎn),將兩個(gè)通氣口中的一個(gè)拆卸下來(lái),改造為霧化杯的通氣出口。如果需要加速霧化箱內(nèi)的氣體流通,可以將另一通氣口也拆下,外接導(dǎo)管至水中。這種改造方法將使霧化箱中的空氣流動(dòng)更加充分。本制作方法充分利用了獨(dú)立通氣鼠籠良好的過(guò)濾通氣特點(diǎn),導(dǎo)入鼠籠內(nèi)的藥物經(jīng)鼠籠上方的過(guò)濾窗過(guò)濾后排到籠外,不會(huì)污染霧化箱外空氣。保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔和實(shí)驗(yàn)人員的安全。

本霧化箱設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單小巧,便于維護(hù)、搬運(yùn),在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中轉(zhuǎn)運(yùn)操作時(shí)只需要帶入霧化器和橡皮筋等材料,方便消毒操作。同時(shí)本霧化箱具有繼續(xù)改裝潛力,除了打開(kāi)另一通氣口作為通氣出口,霧化器還可依據(jù)相同的通氣口大小匹配更大的籠具,為大鼠等更大體積實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的霧化吸入實(shí)驗(yàn)提供可能。

本研究利用家用霧化器和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立通氣鼠籠制作了簡(jiǎn)易實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱。我們利用該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化箱成功建立OVA蛋白誘導(dǎo)的小鼠過(guò)敏性哮喘模型并觀察到明顯的肺組織炎癥表現(xiàn)。該方法為簡(jiǎn)便和低成本地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物霧化實(shí)驗(yàn)提供具有操作性的指導(dǎo)。