微生物甲硫氨酸合成調(diào)控的綜合研究進(jìn)展與展望

趙嫚，彭莉，成浩，應(yīng)向賢，汪釗

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州, 310014)

甲硫氨酸(methionine，Met)，包括L-甲硫氨酸和D-甲硫氨酸兩種構(gòu)型，L-甲硫氨酸是人和動物必需的含硫氨基酸，在生物體內(nèi)具有重要的生理生化功能。具體功能包括參與DNA、蛋白質(zhì)的合成和蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；是精胺、亞精胺和乙烯等的前體，參與細(xì)胞分裂分化、凋亡、穩(wěn)態(tài)和基因表達(dá)等生物生長發(fā)育的各個方面；并通過其主要代謝產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)間接調(diào)節(jié)各種代謝過程，為脂類、蛋白質(zhì)、核酸、生物堿類和植物固醇等多種化合物提供甲基[1]。近年來，Met的需求量大幅度增加，預(yù)計2022年全球市場份額可達(dá)73億美元，其中飼料添加劑是最大的消費市場。此外，Met在食品添加劑、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的需求也呈長期穩(wěn)定增長趨勢[2-5]。

Met的合成主要包括化學(xué)法、酶法和微生物發(fā)酵法3種，目前工業(yè)上主要采用化學(xué)法和化學(xué)-酶法。盡管化學(xué)法和酶法技術(shù)成熟、成本低，但微生物發(fā)酵法因其綠色、高效和周期短等優(yōu)勢，受到研究者的廣泛關(guān)注。Met發(fā)酵法合成的研究主要集中在大腸桿菌(Escherichiacoli)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)中，目前已經(jīng)報道的E.coli和C.glutamicum中Met的最高產(chǎn)量分別約為30 g/L和9.88 g/L[6-15]，如表1所示，該水平距離工業(yè)化應(yīng)用還存在一定的差距。隨著Met市場需求的逐年增加，對提高M(jìn)et產(chǎn)量的研究迫在眉睫。代謝物產(chǎn)量的高低與代謝合成過程中關(guān)鍵基因的相互調(diào)控密不可分。本文將對近幾年Met的合成過程、調(diào)控機制和環(huán)境因素的研究進(jìn)展進(jìn)行全面綜述，以期為Met合成產(chǎn)量的提高提供基礎(chǔ)。

表1 甲硫氨酸產(chǎn)生菌構(gòu)建的典型實例Table 1 Representative examples of the methionine producing strains

1 Met的生物合成

Met能夠在大多數(shù)的植物和微生物中合成，其合成途徑已經(jīng)被完全解析，主要涉及兩個部分，即從頭合成途徑-天冬氨酸合成途徑和硫同化過程(圖1)[16-17]。

1.1 從頭合成途徑

除Met以外，必需氨基酸異亮氨酸、賴氨酸和蘇氨酸也是由該途徑的不同分支產(chǎn)生(圖1)。以C.glutamicum中從頭合成途徑為例，Met合成的具體過程是天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Aspartate kinase, lysC)的催化下形成天冬氨酰-4-磷酸，然后被天冬氨酸半醛脫氫酶(Aspartaldehyde dehydrogenase, asd)催化形成天冬氨酸-4-半醛，后者被高絲氨酸脫氫酶(Homoserine dehydrogenase, hom)氧化成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Homoserine acetyltransderase, metX)的作用下生成O-乙酰-L-高絲氨酸，然后再依次在胱硫醚γ合成酶(Cystathinine γ-synthase, metB)和胱硫醚β裂解酶的作用下分別形成胱硫醚和高半胱氨酸，最后高半胱氨酸在甲硫氨酸合成酶(Methionine synthase, metEH)的作用下，以四氫葉酸(CH3-THF)作為甲基供體合成Met。此外，在C.glutamicum中O-乙酰-L-高絲氨酸還可以在O-乙酰-L-高絲氨酸硫化酶(O-acetylhomoserine sulfhydrylase, metY)的作用下直接合成高半胱氨酸，進(jìn)而合成Met。

在不同的生物中，合成途徑存在一定的差異(圖1, 表2)，如高絲氨酸在C.glutamicum中經(jīng)過高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Homoserine acetyltransferase, HAT)催化形成O-乙酰-L-高絲氨酸，而在E.coli和植物中則分別被高絲氨酸-O-琥珀?；D(zhuǎn)移酶(Homoserine succinyltransderase, metA)和高絲氨酸激酶(Homoserine kinase, HK)催化形成O-琥珀酰-L-高絲氨酸和O-磷酸-L-高絲氨酸[18]。在古細(xì)菌中，天冬氨酸-4-半醛可以在硫化酶的作用下，直接合成高半胱氨酸[17]。

1.2 硫同化

圖1 甲硫氨酸生物合成途徑與調(diào)控Fig.1 Biosynthesis pathway and regulation of Methionine

從頭合成途徑中天冬氨酸直接合成Met需要1個ATP和2個NADPH，無機硫的同化則需要2個ATP和4個NADPH。因此Met的合成除了受到從頭合成途徑和硫同化內(nèi)部途徑關(guān)鍵酶等合成過程的調(diào)控外，還受到能量、輔因子和外界環(huán)境等多種不同層次的綜合調(diào)控。

2 Met合成過程的調(diào)控

2.1 Met合成關(guān)鍵酶的調(diào)控

甲硫氨酸的合成受到多個關(guān)鍵酶的調(diào)控。首先，天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)是Met合成途徑的第一個限速酶，催化ATP依賴的天冬氨酸磷酸化形成天冬氨酰-4-磷酸。在E.coli中AK由thrA、metL和lysC三個基因編碼，這些基因的表達(dá)分別受蘇氨酸、Met和賴氨酸的反饋阻遏調(diào)節(jié)[21]。而在C.glutamicum中AK僅有一個編碼基因lysC，其表達(dá)同時受到蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏[22]。過表達(dá)lysC以及不受賴氨酸反饋抑制的突變體可使最終產(chǎn)物的含量顯著提高。此外，在酶活水平上，AK還受其終端產(chǎn)物反饋抑制調(diào)節(jié)。在C.glutamicum中，對基因lysC進(jìn)行定點突變?yōu)锳279T和G359D，結(jié)果表明，lysC的突變可部分解除AK的活性受蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏抑制[21,23]。高絲氨酸脫氫酶是天冬氨酸合成途徑的關(guān)鍵雙功能酶，包含天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶兩個功能。在E.coli中，高絲氨酸脫氫酶是由thrA和metL兩個基因進(jìn)行編碼。thrA的轉(zhuǎn)錄受到蘇氨酸和異亮氨酸的抑制，具體原因是thrA、thrB(在蘇氨酸合成途徑中編碼高絲氨酸激酶)和thrC(編碼蘇氨酸合成酶)在染色體上組成thrABC操縱子，蘇氨酸和異亮氨酸通過與該操縱子上游的一段前導(dǎo)序列作用，反饋抑制基因的表達(dá)；而metL僅受到Met的反饋抑制。而在C.glutamicum中hom受到蘇氨酸的抑制，且其G378S定點突變可部分解除hom的活性受蘇氨酸和賴氨酸的反饋阻遏抑制[24-25]。在Met的合成過程中，除了Met以外，其下游產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸(S- adenosylmethionine, SAM)也參與到Met的合成調(diào)控，比如metA和metB均受到SAM的反饋抑制，進(jìn)而影響Met的合成。

表2 L-甲硫氨酸生物合成相關(guān)的酶及其編碼基因Table 2 Enzymes and their encoding genes related to the methionine synthesis

在E.coli中，metA、metB和metC位于一個操縱子上，高效表達(dá)該操縱子基因是提高M(jìn)et常用的策略。USUDA等[26]在E.coliW3110 中過表達(dá)metA，使Met的含量從0.13 g/L提高到0.24 g/L。郭謙等[27]在一株經(jīng)過紫外誘變篩選選育出的Met高產(chǎn)菌株E.coliYB12的基礎(chǔ)上，過表達(dá)metA、cysE(絲氨酸合成半胱氨酸途徑中絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因)和編碼Met轉(zhuǎn)運蛋白的yeaS基因，使E.coliYB12中Met的含量從60 mg/L提高到251 mg/L。另外，在1株生產(chǎn)賴氨酸的C.glutamicum菌株中，對metX和metY基因過表達(dá)導(dǎo)致Met的產(chǎn)量提高到16 g/L[28]。因此，Met合成途徑的這些關(guān)鍵酶是調(diào)控其代謝途徑的關(guān)鍵限速酶。WEI等[29]在提高M(jìn)et重要中間體O-乙酰高絲氨酸的研究中，基于蛋白質(zhì)工程的進(jìn)化保守分析和結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的工程化提高了關(guān)鍵酶高絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(Homoserine acetyltransferase， metXlm)的活性且減少反饋抑制，使酶的活性增加了12.5倍，并通過守恒優(yōu)化，最終使產(chǎn)物O-乙酰高絲氨酸產(chǎn)量增加57.14%[29]。

2.2 Met合成競爭途徑的阻斷

天冬氨酸合成途徑中的賴氨酸和蘇氨酸合成途徑是Met合成的2個關(guān)鍵競爭途徑，分別通過天冬氨酸-4-半醛和高絲氨酸實現(xiàn)競爭。研究發(fā)現(xiàn)，2個競爭途徑的去除會為Met的合成提供更多的天冬氨酸-4-半醛和高絲氨酸底物，從而有效提高M(jìn)et的產(chǎn)量。研究中常用的是賴氨酸合成途徑中dapA(在賴氨酸合成途徑編碼二氫二吡啶甲酸合酶)和蘇氨酸合成途徑中thrB的敲除[16]。例如，在C.glutamicum13032中通過thrB的敲除和賴氨酸合成途徑的減弱(dapA中用稀有密碼子GTG代替起始密碼子ATG)，Met的產(chǎn)量從0.89 g/L提高到2.99 g/L，增加了3倍[7]。在E.coliW3110中，通過thrBC的敲除獲得蘇氨酸營養(yǎng)不良菌株，與野生型相比，其Met產(chǎn)量從無法檢測提高到0.008 g/L[26]。吳婷婷[30]在E.coliK-12/pKD46菌株中敲除dapA基因后，其Met的含量提高了2.61倍。

2.3 Met轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Met合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控除了限速酶的表達(dá)受到產(chǎn)物的反饋抑制外，還包括各種調(diào)控蛋白的調(diào)控[31]，如MetJ和MetR。MetJ是Met合成的關(guān)鍵阻遏蛋白，在E.coli中阻遏metL、metA、metB、metC和metE基因的表達(dá)[32]。研究發(fā)現(xiàn)，將MetJ第54位的Ser替換為Asn，可以消除其反饋阻遏作用，提高M(jìn)et的產(chǎn)量[33]。與E.coli相對應(yīng)的，在C.glutamicum中Met的合成和攝入則是由McbR阻遏蛋白調(diào)控。McbR是C.glutamicum硫代謝的全局調(diào)控因子，涉及的基因包括hom、metX、metB、metE和metH等[34]。很多研究已經(jīng)表明，通過對細(xì)菌metJ或mcbR基因的敲除或修飾，可解除其對細(xì)胞生產(chǎn)Met能力的禁錮，使菌株產(chǎn)生更多的Met[6,9,26-27,35]。與MetJ相反，MetR是一類轉(zhuǎn)錄激活因子，過表達(dá)后可大大促進(jìn)Met的合成，前期研究，通過共表達(dá)metE和metR的研究發(fā)現(xiàn)，MetR是metE基因表達(dá)的反式激活因子，然而在MetJ蛋白和SAM的存在下，metR基因的表達(dá)被抑制[36]。

2.4 Met轉(zhuǎn)運體的調(diào)控

菌株經(jīng)過一系列代謝工程改造后，胞內(nèi)氨基酸的積累會抑制其合成途徑關(guān)鍵酶的催化活性，增加其降解途徑的前體可利用性，甚至抑制細(xì)胞生長。因此，Met的轉(zhuǎn)運也成為其生產(chǎn)的限速步驟[31,37]。在E.coli中，過表達(dá)Met輸出蛋白YjeH、YeaS和敲除Met攝入蛋白MetD、MetP均顯著增加了Met的積累[38-39]。在基因工程菌C．glutamicum中敲除Met的攝取蛋白MetQP或過表達(dá)輸出蛋白BrnFE或MetT，Met的含量都顯著提高[40-41]。

3 硫同化對Met合成的調(diào)控

4 NADPH對Met合成的影響

Met的合成從硫同化到從頭合成途徑共需要6個NADPH和3個ATP。因此能量和還原力的提高是保證Met高效合成的關(guān)鍵。NADPH在C.glutamicum和E.coli中分別是以不同的方式進(jìn)行提供。在C.glutamicum中，NADPH主要是通過戊糖磷酸途徑中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH, zwf)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGDH, gnd)，而在E.coli中主要是通過膜結(jié)合的轉(zhuǎn)氫酶合成[48-49]。此外，前人的研究已經(jīng)嘗試了不同策略來增加NADPH的供應(yīng)，最常用的是調(diào)整糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑之間的代謝流量比。C.glutamicum戊糖磷酸途徑中的zwf和gnd進(jìn)行突變以消除其反饋抑制，構(gòu)建了zwfA243T和gndS361F突變體后，氨基酸的產(chǎn)量呈現(xiàn)了不同程度的增加[50]。此外，通過過表達(dá)果糖-1,6-二磷酸酶基因(fbp)，加速碳源從糖酵解轉(zhuǎn)向戊糖磷酸途徑，也顯著增加了還原力的提供[49,51]。此外，BOMMAREDDY等[52]不依賴于戊糖磷酸途徑的想法，僅通過改變天然NAD+依賴的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, gapA)的輔酶專一性來生成NADP+，在提高甘油醛-3-磷酸脫氫酶對NADP+的催化效率的同時，所有受試突變體的氨基酸產(chǎn)量都得到了顯著提高(60%)。因此，糖酵解、戊糖磷酸途徑和三羧酸循環(huán)等初級代謝途徑中能量和輔助因子的通量變化通常會直接影響氨基酸的生物合成，因此，它們?yōu)樯锕こ剔D(zhuǎn)化提供了一個潛在的目標(biāo)，包括與能量和還原力形成相關(guān)的反應(yīng)。

5 環(huán)境營養(yǎng)元素對Met合成的影響

5.1 營養(yǎng)元素對Met合成的影響

碳源是微生物生長的物質(zhì)基礎(chǔ)。在工業(yè)氨基酸發(fā)酵中，葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油和蔗糖是目前最常使用的碳源，其濃度過高或過低均會影響Met的合成。比如，劉俊琦等[53]向培養(yǎng)基中添加高濃度的葡萄糖，導(dǎo)致菌體濃度和Met產(chǎn)量都有所下降。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，不同的菌株對不同碳源的利用具有顯著的順序作用，如酵母菌、E.coli和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)順序利用較為明顯，而C.glutamcum很少表現(xiàn)出對底物碳源的共利用[54]?？梢娞荚吹姆N類和比例對Met的產(chǎn)量有明顯的影響，因此可通過合適的碳源配比來提高M(jìn)et生產(chǎn)水平。

氮源也是微生物生長的必需營養(yǎng)要素，為生物體合成蛋白質(zhì)、核酸及其他含氮化合物提供原料。牛肉膏、蛋白胨及尿素是微生物常利用的氮源。不同的氮源對Met產(chǎn)量和菌體濃度均有影響，和其他氮素相比較，尿素的效果最好，適宜的尿素濃度對Met的產(chǎn)量至關(guān)重要[53]。

無機鹽是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要因子，在Met的合成中不僅提供必需的環(huán)境和營養(yǎng)成分，而且還可以合成Met螯合物。Met螯合物因其具有較高的生物價值，增加牲畜的免疫力，現(xiàn)被廣泛用于飼料生產(chǎn)[55]，如甲硫氨酸硒[56]、甲硫氨酸銅[57-59]、甲硫氨酸鋅[60]和甲硫氨酸酪[61]。此外，在培養(yǎng)基中添加半胱氨酸乙硫氨酸等化合物均可使Met的產(chǎn)量顯著調(diào)高，如KUMAR等[62]在培養(yǎng)基中添加半胱氨酸，可使Met產(chǎn)量從2.34 g/L提高到3.39 g/L。金利群等[63]的研究發(fā)現(xiàn)通過控制發(fā)酵培養(yǎng)基中Na2S2O3的添加量，可顯著提高M(jìn)et的產(chǎn)量；當(dāng)Na2S2O3的添加量在3 g/L時，Met產(chǎn)量可提高41.3%。

5.2 培養(yǎng)條件對Met合成的影響

在發(fā)酵過程中，除了合理的營養(yǎng)元素外，培養(yǎng)條件也是影響Met產(chǎn)量的關(guān)鍵，包括pH、溫度及攪拌速率等。在微生物合成Met的過程中，pH值會直接影響代謝途徑中酶的活性。ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，pH值為7時，E.coli發(fā)酵生產(chǎn)Met產(chǎn)量達(dá)到最高，分別比pH值6.5和7.5時提高37.78%和18.10%，表明中性pH值有助于E.coli發(fā)酵生產(chǎn)Met。溫度影響微生物發(fā)酵生長主要涉及兩個方面即影響菌體自身生長活力、誘導(dǎo)溫度影響代謝途徑蛋白質(zhì)表達(dá)水平和相應(yīng)酶活性[64]。有研究指出，用E.coli作為生產(chǎn)菌株生產(chǎn)Met最適宜溫度是28 ℃，此時參與Met生物合成的關(guān)鍵酶活性增強，Met產(chǎn)量為1.24 g/L，較33 ℃和25 ℃時高1.09倍和2.21倍。攪拌速率是影響細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物生物合成的重要因素。攪拌速度在200～400 r/min最為適宜，當(dāng)攪拌速率為300 r/min時Met的產(chǎn)量最高[13]。

6 總結(jié)和展望

Met具有重要的工業(yè)價值。近幾年，隨著發(fā)酵工程、代謝工程和合成生物學(xué)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，研究者們利用基因工程菌生產(chǎn)Met已經(jīng)成為Met開發(fā)的戰(zhàn)略方向，但是基于目前的研究進(jìn)展，距離工業(yè)化生產(chǎn)仍然有待研究。Met合成途徑已經(jīng)被完全解析，合成途徑的代謝調(diào)控尤其是從頭合成途徑的調(diào)控多數(shù)已經(jīng)被揭示，但是在前體物質(zhì)H2S和天冬氨酸，以及輔因子NADPH和ATP的提供等方面的調(diào)控也是限制Met合成的關(guān)鍵因素，還需要進(jìn)一步探究。本課題組致力于微生物高產(chǎn)Met的探究，前期的研究發(fā)現(xiàn)對各個前體物質(zhì)合成綜合調(diào)控的解析和工程化，是提高M(jìn)et產(chǎn)量的關(guān)鍵。