黃芪多糖生物活性檢測(cè)模型的建立

馬發(fā)順，崔夢(mèng)如，時(shí)志琪，梁秀麗，宋玉偉，元雪湞

(1.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000；2.河南省獸用生物制品研發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000；3.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450000)

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是中草藥黃芪的主要活性成分之一。APS具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能、抗炎等作用[1-3]。張敬芳等[4]的研究發(fā)現(xiàn)APS可降低患糖尿病大鼠的血糖水平，王巖巖等[5]發(fā)現(xiàn)APS對(duì)患糖尿病大鼠腎小管的損傷具有良好修復(fù)作用。Chen 等[6]研究顯示APS能使小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)升高。陳茜等[7]研究表明APS可顯著提高蛋雞的脾指數(shù)和法氏囊指數(shù)。Lin等[8]發(fā)現(xiàn)APS可通過(guò)提高機(jī)體IgA、IgG、IgM的含量從而提高機(jī)體免疫力。左兆云等[9]的研究發(fā)現(xiàn)APS能提高雞蛋品質(zhì)。甄玉國(guó)等[10]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬日糧中添加APS可顯著降低料肉比。上述關(guān)于APS的研究多集中于對(duì)免疫功能、動(dòng)物生產(chǎn)性能等方面的影響，關(guān)于APS生物活性檢測(cè)方面的研究較少[11]。擬采用線性和非線性回歸方法構(gòu)建檢測(cè)模型，并從中選出最優(yōu)模型，作為APS生物活性檢測(cè)時(shí)的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

128只昆明鼠(18～20 g)購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。使用獨(dú)立送排風(fēng)隔離籠具(IVC)和EVC籠具進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。所用飼料為SPF級(jí)全價(jià)飼料，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試驗(yàn)儀器和藥品

電子分析天平(型號(hào)為AB204-N)購(gòu)自上海雙旭電子有限公司。無(wú)菌注射器(規(guī)格為1mL)購(gòu)自河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司。黃芪多糖注射液(規(guī)格為100mL:1g)由河南省獸藥廠提供。生理鹽水(規(guī)格為250mL)購(gòu)自河南科倫藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取獨(dú)立試驗(yàn)設(shè)計(jì)。8種APS樣品均設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，小鼠完全隨機(jī)分組，每組8只，共128只。試驗(yàn)組每只小鼠每天注射APS注射液0.5 mL，對(duì)照組小鼠每天每只注射等量生理鹽水，試驗(yàn)期7 d。最后一次注射后24 h將小鼠處死，稱取體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)等。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

由稱取的體重和脾臟重計(jì)算脾指數(shù)(y)，脾指數(shù)=脾臟重(mg)/體重(g)，按照2015版獸藥典規(guī)定，試驗(yàn)組與對(duì)照組脾指數(shù)之差大于或等于2為合格，否則為不合格。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行試驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異顯著性比較。使用DPS v 7.05進(jìn)行相關(guān)和回歸分析。分別進(jìn)行試驗(yàn)組與對(duì)照組體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)間的相關(guān)分析，并分別建立檢測(cè)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 APS生物活性檢測(cè)結(jié)果

8種APS樣品生物活性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。按照標(biāo)準(zhǔn)判斷，所檢測(cè)樣品A、B、C合格，其余不合格。所檢測(cè)樣品A、B、C試驗(yàn)組和對(duì)照組脾指數(shù)差異極顯著(P<0.01)，其余檢測(cè)樣品試驗(yàn)組和對(duì)照組脾指數(shù)差異不顯著(P>0.05)，脾指數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)支持APS樣品生物活性檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果。

2.2 體重(w)、脾臟重(s)和胸腺重(t)間的相關(guān)性

試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組和對(duì)照組各指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知，試驗(yàn)組脾指數(shù)(y1)與脾臟重(s1)間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，胸腺重(t1)與體重(w1)間存在顯著正相關(guān)(P<0.05)；對(duì)照組脾指數(shù)(y2)與脾臟重(s2)間存在極顯著正相關(guān)(P<0.01)，其余各指標(biāo)間相關(guān)性均不顯著(P>0.05)。

2.3 檢測(cè)模型的建立

2.3.1 試驗(yàn)組檢測(cè)模型

以體重(w1)、脾臟重(s1)和胸腺重(t1)為自變量，以脾指數(shù)(y1)為依變量，建立的直線模型為：y1=6.6956-0.2615w1+0.0388s1+1.6301×10-3t1；建立的二次多項(xiàng)式模型為：y1=-0.923 6+0.058 1w1+0.086 1s1-6.902 3×10-3t1-2.033 7×10-3w1·s1+6.618 8×10-5s1·t1。

直線模型和二次多項(xiàng)式模型擬合度R2分別為0.9978和0.9999。兩模型中自變量與依變量間的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)如表3所示。

由表3可知，直線模型中w1、s1與y1間的偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，而t1與y1間偏相關(guān)系數(shù)不顯著(P>0.05)，從3個(gè)自變量對(duì)依變量通徑分析來(lái)看，s1的通徑系數(shù)最大。二次多項(xiàng)式模型中各項(xiàng)偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，從自變量對(duì)依變量的通徑分析來(lái)看，s1通徑系數(shù)絕對(duì)值最大，其次是w1·s1項(xiàng)。對(duì)試驗(yàn)組建立的直線模型和二次多項(xiàng)式模型進(jìn)行比較，二次多項(xiàng)式型模型比直線模型R2值大，擬合誤差更小，且自變量對(duì)依變量的偏相關(guān)系數(shù)顯著性更高，所以二次多項(xiàng)式模型更優(yōu)。

2.3.2 對(duì)照組檢測(cè)模型

以體重(w2)、脾臟重(s2)和胸腺重(t2)為自變量，以脾指數(shù)(y2)為依變量建立的直線模型為：

y2=3.8439-0.1442w2+0.0365s2+1.0468×10-3t2；

建立的二次多項(xiàng)式模型為：

y2=-0.763 3+0.080 7s2+1.407 6×10-3w22+5.732 3×10-5t22-1.615 8×10-3w2·s2-3.001 5×10-4w2·t2。

直線模型和二次多項(xiàng)式模型擬合度R2分別為0.998和0.9999。兩模型中自變量與依變量間的偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)見(jiàn)表4。

由表4可知，直線模型中w2、s2與y2間的偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)，而t2與y2間偏相關(guān)系數(shù)不顯著(P>0.05)；從3個(gè)自變量對(duì)依變量通徑分析來(lái)看，s2的通徑系數(shù)最大。二次多項(xiàng)式模型中各項(xiàng)偏相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水準(zhǔn)(P<0.01)；從通徑分析來(lái)看，s2通徑系數(shù)絕對(duì)值最大，其次是w2·s2項(xiàng)。直線模型與二次多項(xiàng)式模型比較來(lái)看，二次多項(xiàng)式模型的R2值大于直線模型，擬合誤差小，且各自變量的偏相關(guān)系數(shù)顯著性更高，所以二次多項(xiàng)式模型更優(yōu)。

表4 對(duì)照組自變量與依變量間偏相關(guān)系數(shù)和通徑系數(shù)

2.4 檢測(cè)模型的驗(yàn)證

將各樣品試驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)量值分別代入優(yōu)化模型，所得擬合值及差值見(jiàn)表5。根據(jù)y1與y2的差值判斷APS生物活性是否合格，差值大于等于2為合格，小于2為不合格。根據(jù)模型計(jì)算的8種樣品試驗(yàn)組與對(duì)照組的脾指數(shù)擬合值及差值與實(shí)際檢測(cè)結(jié)果完全相同，可見(jiàn)，按照現(xiàn)行的判斷標(biāo)準(zhǔn)所建立的2個(gè)模型是可行的。

表5 樣品試驗(yàn)組與對(duì)照組的脾指數(shù)擬合值及差值

3 討論與結(jié)論

從8種樣品的各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果來(lái)看，數(shù)據(jù)變異程度較大，試驗(yàn)組與對(duì)照組的差異顯著無(wú)明顯的規(guī)律性。原因可能是：①在試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)沒(méi)有考慮小鼠的性別因素；②試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異較大，試驗(yàn)雖然遵照隨機(jī)原則但不能完全消除動(dòng)物的個(gè)體差異；③試驗(yàn)的樣本量不是特別充足。今后，在進(jìn)行APS生物活性檢測(cè)時(shí)，應(yīng)遵守重復(fù)、隨機(jī)、局部控制原則進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并盡可能增加樣本量，以降低試驗(yàn)誤差。

從相關(guān)分析來(lái)看，試驗(yàn)組和對(duì)照組均是脾臟重與脾指數(shù)間存在極顯著的正相關(guān)(P<0.01)，而胸腺重與脾指數(shù)間相關(guān)不顯著(P>0.05)，在直線回歸分析時(shí)偏相關(guān)系數(shù)也證實(shí)了變量間的相關(guān)關(guān)系。各變量間的相關(guān)分析結(jié)果與元雪湞等[12]的研究結(jié)果相吻合。通徑分析表明，無(wú)論試驗(yàn)組還是對(duì)照組，直線模型中脾臟重對(duì)脾指數(shù)的影響最大，二次多項(xiàng)式模型中脾臟重及體重與脾臟重的互作項(xiàng)對(duì)脾指數(shù)的影響較大。

本研究經(jīng)過(guò)優(yōu)化獲得的試驗(yàn)組和對(duì)照組的二次多項(xiàng)式檢測(cè)模型擬合度均高于直線模型，也高于元雪湞等[12]建立的直線模型，說(shuō)明二次多項(xiàng)式模型更適合于APS生物活性檢測(cè)。按照2015版獸藥典的APS檢測(cè)方法，若把胸腺重也納入到檢測(cè)模型中，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)代入模型驗(yàn)證情況看，胸腺重的納入更能證明模型的可靠性。

通過(guò)試驗(yàn)建立了APS生物活性檢測(cè)模型，試驗(yàn)組為y1=-0.923 6+0.058 1w1+0.086 1s1-6.902 3×10-3t1-2.033 7×10-3w1·s1+6.618 8×10-5s1·t1；對(duì)照組為y2=-0.763 3+0.080 7s2+1.407 6×10-3w22+5.732 3×10-5t22-1.615 8×10-3w2·s2-3.001 5×10-4w2·t2。二次多項(xiàng)式型模型更適用于臨床APS的生物活性檢測(cè)。