HE染色細胞學(xué)涂片和FFPE標本用于EGFR突變檢測的對比分析

紀曉坤，杜 蕓，王 蕊，吳 娟，馬 陽，郭 曉，劉 穎，張 艷

每年全球約138萬人死于肺癌[1]，在中國肺癌的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤的首位，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%。EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，在靶向治療中得到廣泛研究和應(yīng)用，EGFR檢測對于NSCLC靶向治療的選擇至關(guān)重要。酪氨酸激酶抑制劑(TKI)治療NSCLC初期療效顯著，副作用較小。然而，大多數(shù)EGFR突變患者在EGFR-TKI治療期間出現(xiàn)耐藥基因T790M突變，而使EGFR-TKI療效下降、疾病進展。因此，重新檢測EGFR突變狀態(tài)，選擇恰當?shù)腅GFR-TKI成為靶向治療必不可少的選擇。

EGFR檢測的標本均為福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded, FFPE)的組織學(xué)標本，細胞學(xué)標本應(yīng)用較少。但是大多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，無法通過手術(shù)、活檢等獲得FFPE標本進行病理診斷及EGFR[2-4]檢測。但所有患者均可獲得細胞學(xué)標本，且創(chuàng)傷性小，約17.7%的患者僅通過支氣管鏡刷片即可明確診斷[5]。本文著重探討HE染色細胞學(xué)涂片與配對FFPE標本之間EGFR突變狀態(tài)的符合率，并分析FFPE標本失敗的原因，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2012年12月～2018年9月細胞學(xué)確診NSCLC患者275例，細胞學(xué)標本包括支氣管鏡刷片及灌洗液、活檢或手術(shù)切除組織印片、細針穿刺涂片；所有細胞學(xué)標本均有配對FFPE標本。支氣管鏡刷片及灌洗液、活檢或手術(shù)切除印片的細胞學(xué)涂片，與其配對的FFPE標本EGFR檢測同行進行，而遠處轉(zhuǎn)移部位的細針穿刺細胞學(xué)(fine needle aspiration, FNA)涂片及其配對的手術(shù)切除FFPE標本EGFR檢測未同時進行。

細胞學(xué)涂片經(jīng)95%乙醇固定10 min，行HE和免疫細胞化學(xué)染色(SP法)[6]，由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師診斷并判斷腫瘤細胞含量。FFPE標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師診斷并判斷腫瘤細胞含量。

Hagiwara等[7]報道FFPE標本進行基因檢測的癌細胞含量≥1%，若癌細胞含量<1%，則不能明確診斷，第二使用這種樣本進行基因檢測會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。本實驗室用于EGFR檢測的HE染色細胞學(xué)涂片的癌細胞含量≥100個，F(xiàn)FPE標本癌細胞含量≥1%。

1.2 DNA提取、純化和保存每個標本編取一個唯一標識碼，所有實驗均在生物安全柜內(nèi)進行，由經(jīng)過考試合格的衛(wèi)生技術(shù)人員佩戴一次性手套、口罩操作，實驗中所用的移液器槍頭為一次性帶濾芯槍頭。若實驗過程中手套觸碰了樣品，需及時更換手套，避免造成交叉污染。實驗過程為防止氣溶膠污染，逐一加樣迅速蓋緊蓋子。細胞學(xué)涂片用記號筆在載玻片反面標記腫瘤細胞富集區(qū)，用一次性蓋玻片(以防止交叉污染)刮取富集區(qū)的腫瘤細胞(圖1)于相應(yīng)標識碼的EP管中，使用組織DNA提取試劑盒(Cat No. ADx-T101-R)購自廈門艾德生物公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。FFPE標本使用FFPE DNA提取試劑盒(Cat No. ADx-FF01)購自廈門艾德生物公司，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

圖1 刮取HE染色細胞學(xué)涂片上的腫瘤細胞：A.記號筆標記腫瘤細胞富集區(qū)；B.用一次性蓋玻片刮取標記區(qū)域的腫瘤細胞；C.刮取后的細胞學(xué)涂片

超微量紫外分光光度計檢測DNA純度即OD260/OD280比值(1.8～2.0)。細胞學(xué)涂片的DNA上樣濃度為0.4～1 ng/μL，F(xiàn)FPE為1.5～3 ng/μL，剩余DNA于-80 ℃保存。

1.3 EGFR突變檢測EGFR基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)及ABI 7500PCR儀(美國Thermofisher)檢測18～21外顯子的29種突變。8連管每孔包含細胞學(xué)標本DNA 2 ng或FFPE DNA 7.5 ng，按試劑盒說明書分析檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征本組275例患者中女性122例，男性153例；其中226例患者行手術(shù)治療，術(shù)后隨訪出現(xiàn)遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移經(jīng)FNA涂片HE染色和免疫細胞化學(xué)染色確診NSCLC轉(zhuǎn)移(圖2)，HE染色FNA涂片進行EGFR檢測，回顧性分析其手術(shù)切除標本EGFR檢測結(jié)果；余49例HE染色細胞學(xué)涂片及其配對FFPE標本EGFR檢測同時進行。病理特征：247例肺腺癌，2例肺泡細胞癌，1例黏液腺癌，8例腺鱗癌，15例鱗狀細胞癌，2例黏液表皮樣癌。

圖2 A：肺腺癌HE染色；B：TTF-1呈陽性，SP法；C：Napsin A呈陽性，SP法；D：p40呈陰性，SP法

2.2 EGFR檢測275例HE染色細胞學(xué)涂片均成功提取高質(zhì)量、高純度DNA，并完成EGFR檢測(表1)，113例檢測到突變，陽性率41.1%(圖3)，其中G719X突變4例，19del 41例，L858R突變58例，20ins 3例，獲得性耐藥T790M和19del雙突變6例，L858R和S768I雙突變1例。113例FFPE標本檢測有EGFR突變，其中G719X、L858R、20ins、L858R和S768I雙突變結(jié)果與細胞學(xué)涂片結(jié)果一致，19del 47例，未檢測到T790M和19del雙突變(表2)。2例EGFR野生型FFPE標本檢測失敗。

圖3 HE染色細胞學(xué)涂片檢測EGFR突變

表1 275例HE染色細胞學(xué)涂片EGFR突變檢測

表2 HE染色細胞學(xué)涂片與配對FFPE標本EGFR突變的對比分析

3 討論

目前，細胞學(xué)涂片檢測EGFR的報道較少[8-10]。巴氏、瑞氏染色的細胞涂片是進行基因檢測的最佳選擇，尤其是在細胞塊細胞含量不足時[8,11]。Mitiushkina等[12]利用歸檔的HE染色涂片提取DNA進行基因檢測結(jié)果不穩(wěn)定，有2例失敗。本組成功檢測275例HE染色細胞學(xué)涂片的EGFR突變狀態(tài)，并對比分析其配對FFPE標本的檢測結(jié)果。本組有107對EGFR突變和160對野生型NSCLC患者結(jié)果完全吻合；6例患者手術(shù)切除FFPE標本為19del，而遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標本經(jīng)HE染色FNA涂片為19del和T790M雙突變；2例遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標本經(jīng)HE染色FNA涂片結(jié)果為野生型，而其配對的手術(shù)切除FFPE標本檢測失敗。查閱病史資料有6例19del和T790M雙突變的HE染色FNA涂片患者，在手術(shù)切除后接受EGFR-TKI治療。結(jié)果顯示：與FFPE標本相比，HE染色細胞學(xué)涂片是DNA提取和EGFR檢測更可靠的選擇，并能更好的指導(dǎo)臨床用藥。

由于FFPE標本提取的DNA片段化，用PCR法檢測EGFR的失敗率較高[13]。本實驗進一步證實，DNA暴露于福爾馬林和石蠟等使其產(chǎn)生交聯(lián)和片段化，不適用于PCR檢測。2例失敗FFPE標本保存5年，提取的DNA片段化嚴重，無法用PCR法檢測基因狀態(tài)。因此細胞學(xué)標本成為EGFR檢測更好的選擇，并能指導(dǎo)TKI治療。

細胞學(xué)標本適用于腫瘤晚期不能行手術(shù)的患者，且創(chuàng)傷??；提取的DNA質(zhì)量高、完整性好。HE染色細胞學(xué)涂片進行EGFR檢測，可使細胞病理學(xué)醫(yī)師在提取DNA前觀察腫瘤細胞含量，避免因細胞塊和活檢FFPE標本腫瘤細胞含量不足而出現(xiàn)假陰性。HE染色細胞學(xué)涂片進行EGFR檢測與FFPE標本相比具有以下優(yōu)點：(1)明確診斷并直接評估腫瘤細胞含量；(2)無需額外取材，且省時省力；(3)避免DNA暴露于福爾馬林和石蠟中產(chǎn)生交聯(lián)和片段化；(4)及時進行EGFR檢測，避免延誤患者的靶向治療。Betz等[8]認為，細胞病理學(xué)專家應(yīng)在有限的細胞學(xué)上最大限度地發(fā)揮細胞學(xué)標本的用途。

研究表明，細胞學(xué)標本和FFPE標本在EGFR檢測中具有良好的一致性。此外，對于多年保存的FFPE樣本在提取的DNA嚴重片段化時，用細胞學(xué)標本進行EGFR突變檢測是一個更好的選擇。