候選結(jié)核疫苗的評價模型

楊淑鳳， 鄧國英， 白 璐， 孫文長*

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，遼寧 大連 116044; 2.大連市海關(guān)技術(shù)中心，遼寧 大連 116022)

卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)作為唯一合法使用的預(yù)防結(jié)核病疫苗，在一定程度上能降低兒童播散性結(jié)核，例如結(jié)核腦膜炎和粟粒性結(jié)核的發(fā)病，但無法提供充足的保護力。所以結(jié)核病依然是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。尤其是多重耐藥結(jié)核(multidrug-resistant TB，MDR-TB) 和泛耐藥結(jié)核(extensively drug-resistant TB，XDR-TB)的出現(xiàn)。僅2016年，在全球確證的662萬結(jié)核病例中就有約15萬MDR-TB，8千余例XDR-TB[1]。因此篩選更高保護力的候選疫苗迫在眉睫。到目前為止，約有12種處在不同臨床試驗階段的候選疫苗[1]，這些疫苗在進(jìn)入臨床試驗前必須評價其安全性、免疫原性和有效性[2]。本文從體內(nèi)和體外兩個方面論述臨床試驗前的疫苗評價體系，對候選疫苗評價體系的充分認(rèn)識是篩選優(yōu)質(zhì)候選疫苗的重要依據(jù)。

1 體內(nèi)評價體系

1.1 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tb)攻擊模型

1.1.1 攻擊對象 使用M.tb攻擊模型來評價候選疫苗的有效性，是指在疫苗接種后讓動物感染M.tb。攻擊菌株多為標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv，常使用的動物包括小鼠、豚鼠以及非人類靈長類(non-human primates, NHP) 動物等。小鼠因其低成本、大樣本數(shù)據(jù)易獲得以及易于標(biāo)準(zhǔn)化實踐操作等優(yōu)點，已成為疫苗評價中最普遍使用的初篩動物模型，常采用C57Bl/6、BALB/c以及C3HeB/FeJ等品系。值得一提的是，使用C3HeB/FeJ品系的小鼠建模能形成中性粒細(xì)胞滲出、損傷嚴(yán)重并發(fā)展為液化為主要特征的病灶，與人體結(jié)核滲出液化病灶非常相似[3]，因此，很多候選疫苗多采用C3HeB/FeJ品系建模。此種小鼠模型與人暴露在活動肺性結(jié)核的高風(fēng)險非常相似，因此也常用于控制此類人群感染的疫苗評價[4]。需要指出的是，小鼠缺乏針對M.tb糖脂抗原所必需的CD1b[5]。豚鼠模型多應(yīng)用于經(jīng)過小鼠模型初篩成功的候選疫苗的進(jìn)一步有效性評價，而豚鼠模型的結(jié)果往往也是該候選疫苗能否進(jìn)入臨床試驗的重要“門檻”[5]。非人靈長類動物因其與人類近源性、高度相似的免疫反應(yīng)，成為評價候選疫苗進(jìn)入臨床試驗中最具有吸引力的工具[6]，但因高成本及對人員專業(yè)性的要求，使得NHP模型僅應(yīng)用在經(jīng)過小鼠模型、豚鼠模型篩選后的進(jìn)一步確證中。

1.1.2 攻擊途徑M.tb攻擊模型常用的攻擊途徑為低劑量氣溶膠。以小鼠模型為例，在設(shè)備封閉空間里，利用2 μm的氣溶膠，通過呼吸道使小鼠肺部接種50 CFUs(colony forming units)的M.tb[7]。低劑量氣溶膠途徑建立的攻擊模型，僅能模擬人群感染M.tb后損傷被控制或者細(xì)菌增殖但又不引起滲出和空洞的免疫狀態(tài)。此外，在低劑量氣溶膠方法基礎(chǔ)上建立模型后，持續(xù)使用抗結(jié)核藥物至病灶中僅存耐藥M.tb，則能建立起潛伏感染小鼠模型。此模型常用于評價某些治療型疫苗的效果[8]。 除氣溶膠途徑外，還有氣管內(nèi)接種途徑，通過大劑量(1×106CFUs) 的M.tb氣管內(nèi)接種，形成吸入性肺炎。氣管接種途徑目前主要應(yīng)用于M.vaccae候選疫苗的測試[9]。目前認(rèn)為此類疫苗有助于Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)門h1反應(yīng)[9]。最新的一個BCG接種途徑研究可以說是結(jié)核疫苗領(lǐng)域中的一個重大革新：改變傳統(tǒng)的BCG接種途徑，經(jīng)靜脈注射免疫恒河猴。發(fā)現(xiàn)這種免疫接種途徑能在恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)出針對M.tb接近100%的保護力[10]。這個重大發(fā)現(xiàn)也說明BCG產(chǎn)生免疫保護的機制應(yīng)該是細(xì)胞免疫、體液免疫和固有免疫的綜合作用結(jié)果[10]。

1.1.3 評價指標(biāo)M.tb攻擊模型常用的評價指標(biāo)包括肺部荷菌量、肺部病理評分以及受試對象的存活期。而候選疫苗優(yōu)于傳統(tǒng)BCG的標(biāo)準(zhǔn)則是在攻擊3周后，肺部的荷菌量相對于對照組至少要降低0.7 log10CFUs以上[2]。需要指出的是，無論哪種動物模型都不能完整地模擬出人類M.tb的感染狀態(tài)。

1.2 BCG攻擊模型

1.2.1 攻擊對象 BCG攻擊模型最大的優(yōu)勢就是受試對象可以是人，這在候選結(jié)核疫苗有效性評價中最具應(yīng)用前景。在可控的條件下，以人作為受試對象來評價疫苗的有效性，在瘧疾疫苗[11]和傷寒疫苗[12]研究中有過先例。BCG作為活菌疫苗非常安全，可在人體內(nèi)短期存活復(fù)制，能夠引起可控的短期分枝桿菌感染，可使用BCG攻擊人[13]。此外，在疫苗篩選最初階段，在實驗室階段達(dá)不到人體使用標(biāo)準(zhǔn)時，也可以使用動物作為BCG攻擊的受試對象，例如兔子[14]。BCG攻擊模型規(guī)避了專業(yè)實驗室的局限(M.tb攻擊必須在生物安全級別為3級的實驗室操作)和人員感染的風(fēng)險，在候選疫苗評價中極具應(yīng)用前景。

1.2.2 攻擊途徑 目前報道，BCG攻擊的途徑為受試對象皮內(nèi)注射。通過在志愿者皮內(nèi)接種標(biāo)準(zhǔn)劑量的BCG和安卡拉病毒85A疫苗(Modified virus Ankara expressing the conserved mycobaterial 85A，MVA85A)，兩周后活檢攻擊部位的組織，評價人體的抗結(jié)核免疫能力[13]。由于皮內(nèi)注射與M.tb實際感染方式存在差異，因此，BCG氣溶膠攻擊模型還在探索中[15]。

1.2.3 評價指標(biāo) BCG攻擊模型的評價指標(biāo)是通過測定攻擊部位活體組織的BCG荷量反映，即CFUs數(shù)目以及菌DNA定量，來反映人體的抗結(jié)核免疫能力[13]。此外，通過對攻擊劑量的比較，發(fā)現(xiàn)在志愿者能承受范圍內(nèi)，高劑量組(即3倍于標(biāo)準(zhǔn)劑量)結(jié)果檢測更為靈敏[13]。

1.3 其他模型

出于人道主義以及動物的替代、減少和優(yōu)化(replacement, reduction and refinement，3R)原則，低感知的動物模型也應(yīng)用在結(jié)核疫苗評價研究中[15]。低感知動物包括阿米巴、果蠅和斑馬魚等。尤其是海洋分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)感染的斑馬魚能模擬出人類結(jié)核病急性和潛伏感染狀態(tài)，因此，也是很多治療性疫苗和DNA疫苗經(jīng)常使用的模型[15]。

2 體外評價體系

盡管還沒有明確的生物標(biāo)記預(yù)示機體對M.tb的保護力，但一些候選疫苗的評價結(jié)果也揭示了某些免疫細(xì)胞和抗體與M.tb保護力相關(guān)，例如在MVA85A的IIb臨床測試中，雖然結(jié)果顯示接種和未接種與傳統(tǒng)BCG并無明顯的保護力差異，但分泌IFN-γ的BCG抗原特異的T細(xì)胞和高效價的Ag85A IgG與M.tb保護力相關(guān)[16]。這些與免疫保護相關(guān)的生物標(biāo)記物的確定加快了候選疫苗的研發(fā)，某種程度上也推動了候選疫苗進(jìn)入臨床前試驗的進(jìn)程，為候選疫苗進(jìn)入臨床I期試驗提供了有效的免疫原性相關(guān)檢測指標(biāo)。目前應(yīng)用最多的體外評價指標(biāo)是結(jié)核菌生長抑制試驗(mycobacterial growth inhibition assays，MGIAs)等。

2.1 MGIAs

MGIAs是指在體外將巨噬細(xì)胞等和M.tb等共培養(yǎng)，模擬分枝桿菌感染后，加入疫苗接種前后受試對象的全血或者某些類型免疫細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞，通過評價機體或者特種類型免疫細(xì)胞對M.tb生長的抑制能力，來反映該疫苗的有效性。受試對象可以是人，也可以是動物(如?；蛘咝∈?。MGIAs檢測的M.tb也不限H73Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株，還可以是分離到的各種臨床強毒株[17]。此外，MGIAs也避免了對動物的體內(nèi)攻擊，是對動物3R原則的很好體現(xiàn)。MGIAs除了主要反映Th1類細(xì)胞對M.tb的清除能力外，還反映了體液免疫如特異抗體、天然免疫細(xì)胞包括抗原遞呈細(xì)胞(樹突細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等對M.tb的清除能力[17]。

2.2 生物信息學(xué)和數(shù)學(xué)模型

已知M.tb和宿主的基因序列，同樣能應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行計算機推演來確定候選結(jié)核疫苗[15]，例如熟知的BCG與M.tb基因序列相比較后確定的差異區(qū)域RD(region of difference)，很多亞單位疫苗成分是RD蛋白；通過生物信息學(xué)方法分析RD蛋白與人類白細(xì)胞抗原I等位基因的親和力，根據(jù)高親和力確定潛在的候選疫苗抗原；生物信息法還可以確定潛在的激活人類CD8+T細(xì)胞的M.tb抗原[18]。此外，隨著電子技術(shù)的快速發(fā)展，很多數(shù)學(xué)對接模型、抗原預(yù)測軟件不斷產(chǎn)生和更新，例如基于VaxiJen預(yù)測抗原軟件和氨基酸序列比對原理的NERVE(new enhaced reverse vaccinology enviroment)預(yù)測的6個候選結(jié)核疫苗[19]。這些數(shù)字化模型更體現(xiàn)低成本、高效性和精準(zhǔn)性，也是對體內(nèi)動物模型3R原則的體現(xiàn)和運用。

3 疫苗評價模型數(shù)據(jù)解析時需考慮的因素

3.1 體內(nèi)模型的種屬差異

體內(nèi)模型，如目前廣泛使用的動物模型，與人類的種屬差異影響其結(jié)果對人類臨床試驗的預(yù)測。NHP模型雖然近源，但也因其高成本和倫理學(xué)等因素使其不能作為常規(guī)篩選模型。正因為如此，NHP模型更應(yīng)統(tǒng)一流程并規(guī)范影響因素，以便不同地區(qū)課題組的數(shù)據(jù)具有比較性和綜合分析性，最大化發(fā)揮NHP模型的價值。被寄予厚望的MVA85A，在小鼠模型、豚鼠模型、NHP模型以及牛等體內(nèi)的表現(xiàn)均優(yōu)于傳統(tǒng)BCG的保護，但在嬰幼兒的臨床IIb試驗中并未表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)BCG的保護力[16]，說明也許種屬差異是其中的原因，另外也可能是在MVA85A的IIb臨床測試中，受試對象年齡差異導(dǎo)致，動物模型受試者均為成年，而臨床試驗對象為嬰幼兒[20]。因此，體內(nèi)模型數(shù)據(jù)對候選疫苗進(jìn)入臨床試驗的意義重大，有賴于更多M.tb保護力的生物標(biāo)記物的確證。

3.2 體內(nèi)模型的攻擊菌株和暴露時間

體內(nèi)模型(如動物模型)采用的攻擊菌株多為單一的實驗室可控標(biāo)準(zhǔn)毒株H37Rv，感染方式多為持續(xù)暴露在高劑量的感染源環(huán)境中。人群感染M.tb涉及多個免疫機制的復(fù)雜過程，而衡量疫苗保護力的唯一標(biāo)準(zhǔn)是是否感染M.tb。加上目前臨床分離的菌株及其毒性和耐藥性多樣，與實驗室標(biāo)準(zhǔn)株有差異，因此，菌株和暴露時間也影響體內(nèi)動物模型對人群臨床試驗的預(yù)測。

3.3 臨床試驗設(shè)置

人群臨床試驗綜合考慮因素眾多，包括受試對象的年齡、性別、BCG成疤歷史等。要綜合首要設(shè)定因素遴選受試對象[21]。試驗受干擾的因素也很多，包括飲食、對環(huán)境中其他分枝桿菌和寄生蟲等病原體的暴露程度等等，而這些因素在臨床前的體內(nèi)外評價模型中可被規(guī)范并降低[2]。因此臨床試驗的復(fù)雜試驗參數(shù)也影響臨床前的體內(nèi)外模型數(shù)據(jù)在人群臨床試驗重現(xiàn)。MVA85A的IIb臨床試驗沒有再現(xiàn)臨床試驗前動物模型的保護力，就是一個實例[21]。

3.4 疫苗保護效果的界定

目前，對候選疫苗的篩選都是以保護力是否高于BCG為標(biāo)準(zhǔn)的，BCG在人群中的保護力約為60%[2]。動物模型中對候選疫苗有效性的界定，依據(jù)的是對疾病相關(guān)癥狀如肺脾的荷菌量、病理表現(xiàn)以及存活期等與BCG對照組是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。而在人群試驗中，這些依據(jù)則不能作為界定標(biāo)準(zhǔn)，人群中對疫苗保護力界定的唯一標(biāo)準(zhǔn)就是感染M.tb。很多候選疫苗在動物模型中能降低0.5～1.0 log10CFUs的荷菌量， 這對于其在人群中阻止感染的程度還不得而知[2,20]。

4 小 結(jié)

到目前為止，所有的候選疫苗還沒有一個能在評價模型中預(yù)防M.tb感染的發(fā)生。而人類感染結(jié)核是個非常復(fù)雜的過程，結(jié)果既有感染痊愈者，又有潛伏感染者，還有復(fù)發(fā)者以及活動性和播散性結(jié)核[22]。在目前缺乏疫苗保護力界定標(biāo)準(zhǔn)的情況下，進(jìn)行臨床試驗前評價依然是篩選候選疫苗的首選。對候選疫苗評價模型的充分認(rèn)識和模型數(shù)據(jù)的充分利用將有利于提高評價模型對人群的預(yù)測價值，也是動物3R人文精神的體現(xiàn)。