頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性與相關(guān)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

陳 悅 劉 蓉 董芝芝 趙秋霞

2019年中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告[1]指出，卒中是中國(guó)人群死亡的首要原因。部分卒中由動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂所致[2]，早期檢測(cè)斑塊的易損性有助于識(shí)別發(fā)生卒中的高風(fēng)險(xiǎn)患者[3]。蛋白質(zhì)可影響動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊的發(fā)生和發(fā)展，了解蛋白質(zhì)在易損斑塊中的作用機(jī)制，評(píng)估斑塊的易損性，可預(yù)測(cè)卒中發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

1 斑塊易損性

易損斑塊是指易發(fā)生血栓形成，具有破裂傾向和(或)進(jìn)展迅速的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[4]。與“易損斑塊”意義相近的概念包括高危斑塊、危險(xiǎn)斑塊和不穩(wěn)定斑塊。美國(guó)心臟學(xué)會(huì)(America Heart Association，AHA)根據(jù)斑塊的病理學(xué)特征(斑塊的形態(tài)、成分和含量等)將其分為不同的類型[5]，診斷依據(jù)為富含脂質(zhì)的壞死核心、大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、斑塊內(nèi)出血和薄纖維帽的形成[6]，其中富含脂質(zhì)的壞死核心Ⅳ-Ⅴ型和р型為易損斑塊。近年研究[5]指出，斑塊的構(gòu)成成分及其結(jié)構(gòu)較管腔狹窄程度更能決定斑塊易損性，可更有效地預(yù)測(cè)卒中的發(fā)生、發(fā)展。數(shù)據(jù)顯示，全球每年有1 500萬(wàn)人發(fā)生卒中，中國(guó)缺血性腦卒中的總體患病率為1 596/10萬(wàn)人，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[7]。研究[5]結(jié)果表明，斑塊易損性的增加可通過(guò)頸動(dòng)脈狹窄和(或)閉塞、斑塊破潰形成潰瘍、繼發(fā)血栓形成等途徑引起腦組織低灌注，是缺血性腦卒中的重要發(fā)生機(jī)制。因此，早期識(shí)別易損斑塊對(duì)預(yù)防缺血性腦卒中至關(guān)重要，其中蛋白質(zhì)對(duì)斑塊易損性的影響顯著。

2 蛋白質(zhì)與斑塊易損性

蛋白質(zhì)是一種以氨基酸為基本單位的生物高分子有機(jī)化合物，其對(duì)調(diào)節(jié)生理功能、維持新陳代謝起重要作用。研究[8]結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的活性、種類及其表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))通過(guò)影響血管內(nèi)皮功能、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重塑和降解、脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞的積累等過(guò)程影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性。

2.1 與血管內(nèi)皮功能有關(guān)的蛋白質(zhì) 血管內(nèi)皮具有屏障作用，可合成和釋放多種內(nèi)皮衍生血管活性因子，影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞皺縮使細(xì)胞間的連接中斷，并使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)嗜鋨物增多，糖原和ATP減少，改變細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，致內(nèi)皮保護(hù)屏障受損，阻礙動(dòng)脈分支處的血流，刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，增加脂蛋白的通透性，破壞內(nèi)皮細(xì)胞的連續(xù)修復(fù)，驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞聚集。當(dāng)巨噬細(xì)胞超負(fù)荷無(wú)法清除脂蛋白時(shí)，巨噬細(xì)胞凋亡形成富含脂質(zhì)的壞死核心，增加斑塊的易損性[8-9]。因此，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙不僅是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素，對(duì)晚期斑塊的易損性也有重要影響。血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)主要通過(guò)影響血管內(nèi)皮功能發(fā)揮其生物活性，進(jìn)而影響斑塊的易損性。

VE-cadherin是血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附的主要分子，具有鈣離子依賴性和內(nèi)皮特異性，主要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)維持血管的完整性起重要作用，細(xì)胞膜結(jié)合的VE-cadherin減少將導(dǎo)致血管屏障功能喪失[10]。VE-cadherin胞外結(jié)構(gòu)域與貽貝黏蛋白融合并相互作用，能有效增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞黏附，提高內(nèi)皮中緊密連接蛋白水平，促進(jìn)血管內(nèi)皮化。研究[11]發(fā)現(xiàn)，VE-cadherin內(nèi)皮化和磷酸化可增加內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，破壞其屏障功能；表明當(dāng)VE-cadherin結(jié)構(gòu)受損時(shí)，易損斑塊更易發(fā)生破裂。有學(xué)者通過(guò)超聲測(cè)量急性腦卒中患者的頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度，以及有無(wú)粥樣硬化斑塊形成，并檢測(cè)其血清VE-cadherin水平；結(jié)果顯示，與頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度正常和增厚的患者相比，頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊患者血清VE-cadherin水平更高[12]。其原因可能為血管內(nèi)皮損傷后，大量VE-cadherin進(jìn)入血液，破壞血管內(nèi)皮，進(jìn)而加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。

OPN是一種酸性糖蛋白，是小整合素結(jié)合n連接糖蛋白家族的成員，在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)[13-14]?？赏ㄟ^(guò)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的鈣化、遷移和增殖，加速內(nèi)皮損傷，促進(jìn)新生內(nèi)膜形成并增加管腔的狹窄程度，加速動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[15]。有學(xué)者采用RT-PCR檢測(cè)人頸動(dòng)脈穩(wěn)定斑塊和易損斑塊中OPN水平，并研究細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶C(PKC)信號(hào)傳導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)易損斑塊中OPN水平較低，而兩種信號(hào)傳導(dǎo)通路水平顯著升高，提示激活ERK和PKC通路可能降低OPN水平，增加斑塊的易損性[16]。

2.2 與ECM有關(guān)的蛋白質(zhì) ECM主要由吞噬泡沫細(xì)胞的血管平滑肌細(xì)胞構(gòu)成，在維持纖維帽的強(qiáng)度中起重要作用[16]。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，ECM降解與重塑平衡發(fā)生異常，破壞纖維帽的功能和完整性，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移[17]，觸發(fā)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血栓形成，增加斑塊易損性[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、白細(xì)胞分化抗原147(cluster of differentiation，CD147)、組織蛋白酶主要影響ECM的降解與重塑，對(duì)增加斑塊的易損性發(fā)揮重要作用。

MMP屬于鈣依賴性含鋅蛋白酶超家族[18]，由巨噬細(xì)胞合成和分泌，在動(dòng)脈壁中普遍存在，對(duì)維持ECM的平衡起重要作用[19]。Chen等[20]采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)出人易損斑塊中MMP2和MMP9的水平較高，可能是通過(guò)破壞膠原纖維和彈性纖維，進(jìn)而降解ECM，損壞纖維帽的功能，增加斑塊的易損性。MMP9作為易損斑塊的潛在生物學(xué)標(biāo)志物,在缺血性腦血管病的預(yù)防、診斷和治療方面具有重要的臨床意義。也有研究[21-22]結(jié)果表明，MMP4水平升高可激活MMP2，直接降解Ⅰ型膠原，并通過(guò)激活MMP的其他亞型，間接促進(jìn)ECM的降解。

CD147被稱為細(xì)胞外MMP誘導(dǎo)因子，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，為免疫球蛋白超級(jí)家族成員[23]，可作為MMP的直接細(xì)胞外誘導(dǎo)劑，促進(jìn)單核細(xì)胞向血管壁遷移并調(diào)節(jié)MMP的活性，降解ECM，參與易損斑塊的發(fā)生、發(fā)展[24]。研究[25]發(fā)現(xiàn)，人易損斑塊中血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量可溶性CD147，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞不斷分泌MMP，加快斑塊內(nèi)部基質(zhì)成分的降解，增加斑塊的易損性。

Cat是一組內(nèi)溶酶體蛋白酶，可調(diào)節(jié)所有有核細(xì)胞中半胱氨酸蛋白酶的活性，并平衡ECM的產(chǎn)生與降解[26]。Cat有多種亞型，其中Cat K、S和V 3種亞型可使ECM降解[27]。Zhao等[26]根據(jù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)將其分為穩(wěn)定斑塊組和易損斑塊組，檢測(cè)兩組患者血清中Cat K和胱抑素C的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cat K因具有膠原酶、彈性蛋白酶活性的作用在易損斑塊中表達(dá)上調(diào)，而胱抑素C因是Cat K的重要內(nèi)源性抑制劑而在易損斑塊中表達(dá)下調(diào)，兩者可共同降解ECM，增加斑塊的易損性。

2.3 與脂蛋白累積有關(guān)的蛋白質(zhì) 脂蛋白是富含膽固醇的特殊大分子蛋白質(zhì)，主要在肝細(xì)胞表面與載脂蛋白結(jié)合并分泌至血液中，維持體內(nèi)的脂質(zhì)平衡。脂質(zhì)代謝紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理因素，而膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transportation，RCT)在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。RCT主要是指高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)通過(guò)與膽固醇受體相互作用，介導(dǎo)游離膽固醇從動(dòng)脈壁內(nèi)膜流出轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行代謝，并以膽汁酸的形式排出的過(guò)程，可降低血漿中膽固醇水平，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[28]。HDL具有抗氧化、消除炎癥、抑制細(xì)胞凋亡和血管擴(kuò)張等作用，是血漿中主要的抗動(dòng)脈粥樣硬化因子[29]。RCT通路受損，可導(dǎo)致HDL水平降低、血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平升高，使巨噬細(xì)胞對(duì)脂蛋白的清除超負(fù)荷，促進(jìn)脂質(zhì)沉積、內(nèi)皮凋亡、單核細(xì)胞黏附和血栓形成，從而增加斑塊的易損性[9]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/Kexin9型(proproten convertase subtilisin/Kexin type 9，PCSK9)、人血清對(duì)氧磷酶(paraoxonase1，PON1)等生物活性物質(zhì)通過(guò)影響脂蛋白的累積,進(jìn)而影響斑塊的易損性。

PCSK9屬于哺乳動(dòng)物絲氨酸蛋白酶[30]，是肝臟合成的一種循環(huán)蛋白，在肝細(xì)胞中表達(dá)，由信號(hào)肽、起始序列、催化結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸和組氨酸的C-末端結(jié)構(gòu)域組成。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域與肝細(xì)胞膜上低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDL-R)的表皮生長(zhǎng)因子前體同源結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)溶酶體降解，減少LDL-R的再循環(huán)并下調(diào)其活性，升高血液中LDL水平[31]，影響RCT通路，使膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡[32]，增加斑塊的易損性。

對(duì)氧磷酶1是一種鈣依賴性酯酶，通過(guò)與HDL結(jié)合，在RCT通路中起核心作用[33]，在血清中主要以HDL為載體，與血清載脂蛋白A-1緊密結(jié)合，即通過(guò)抑制LDL氧化修飾，降低體內(nèi)氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)水平，破壞溶血磷脂，來(lái)降低斑塊的易損性[34]。Arslan等[33]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)氧磷酶1活性及其表達(dá)上調(diào)與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，其可能通過(guò)延緩LDL氧化進(jìn)程、減少HDL氧化損傷、抑制泡沫細(xì)胞形成等途徑影響斑塊易損性。

2.4 蛋白質(zhì)與炎癥細(xì)胞 動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞在斑塊的形成中起核心作用，可誘導(dǎo)易損斑塊破裂導(dǎo)致的缺血性腦卒中發(fā)生。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)多發(fā)生在斑塊的“肩部”區(qū)域，內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)可使單核和(或)巨噬細(xì)胞聚集，刺激新生血管生成，產(chǎn)生自由基、氧化劑和黏附分子，再激活炎癥反應(yīng)，形成內(nèi)皮抑制與炎癥激活的惡性循環(huán)[21]，從而增加斑塊的易損性。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、NLRP3炎癥小體通過(guò)影響炎癥細(xì)胞的聚集對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展產(chǎn)生影響。

MCP-1是趨化細(xì)胞因子蛋白的成員，參與單核細(xì)胞向活動(dòng)性炎癥部位募集[35]。MCP-1通過(guò)趨化因子受體2導(dǎo)致內(nèi)皮炎癥反應(yīng)發(fā)生，促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集，使巨噬細(xì)胞過(guò)度表達(dá)黏附分子、細(xì)胞因子和MMP，促進(jìn)脂質(zhì)累積和ECM降解[36]，增加斑塊的易損性。Ohman等[37]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)含MCP-1的小鼠進(jìn)行內(nèi)臟脂肪移植可顯著促進(jìn)其動(dòng)脈粥樣硬化的形成；表明在內(nèi)臟脂肪組織移植中，MCP-1通過(guò)加劇炎癥反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，增加斑塊的易損性。

NLRP3炎癥小體是由傳感器蛋白NLRP3組成的一種細(xì)胞質(zhì)蛋白復(fù)合體[38]，主要在人頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。激活NLRP3炎癥小體可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移，增加溶酶體中脂質(zhì)沉積，有助于巨噬細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁，刺激泡沫細(xì)胞形成[39]，調(diào)節(jié)Cat活性，激活促炎癥細(xì)胞因子(即IL-1β和IL-18)，驅(qū)動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，提高腦卒中的發(fā)生率[40]。研究[41]發(fā)現(xiàn)，與單純糖尿病患者(對(duì)照組)相比，2型糖尿病合并頸動(dòng)脈粥樣硬化患者(試驗(yàn)組)的血清NLRP3 mRNA水平顯著升高；再將試驗(yàn)組分為斑塊組和內(nèi)-中膜增厚組(斑塊形成的早期)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)-中膜增厚組患者的血清中NLRP3、IL-18水平均顯著高于斑塊組，可以推斷在斑塊形成的早期階段，NLRP3炎癥小體通路活性顯著增強(qiáng)。目前，抑制NLRP3炎癥小體是預(yù)防和治療心、腦血管并發(fā)癥的新方法，NLRP3炎癥小體的激活機(jī)制和分子靶向藥物尚需進(jìn)一步的研究闡明。

3 總結(jié)與展望

頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性是內(nèi)在多基因、外界環(huán)境和相關(guān)蛋白質(zhì)等異常調(diào)控共同作用的結(jié)果，目前仍是國(guó)內(nèi)外臨床研究的熱點(diǎn)，對(duì)預(yù)防缺血性腦卒中具有重要意義。通過(guò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的深入研究發(fā)現(xiàn)，斑塊的易損性并不僅僅取決于管腔的狹窄程度，斑塊的生物學(xué)成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)也起著重要作用。其中，蛋白質(zhì)的活性、種類及其表達(dá)(上調(diào)或下調(diào))對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性至關(guān)重要。然而，與斑塊易損性相關(guān)的蛋白質(zhì)種類繁多，不同蛋白質(zhì)的臨床研究進(jìn)展不一，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段的蛋白質(zhì)表達(dá)水平具有明顯差異。目前的檢測(cè)手段在評(píng)估斑塊易損性和預(yù)測(cè)心、腦血管事件方面尚不成熟，希望將來(lái)有更多斑塊易損性與相關(guān)蛋白質(zhì)之間作用機(jī)制的研究來(lái)指導(dǎo)臨床早期診斷易損斑塊，探索有效的治療方法，預(yù)防缺血性腦卒中，以降低其致殘率和致死率。