單細(xì)胞測序及其在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用

朱 婷， 耿 銘， 李慶偉

(1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116081；2.遼寧師范大學(xué) 七鰓鰻研究中心，遼寧 大連 116081)

單細(xì)胞測序(single-cell sequencing，SCS)是指在單個細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀組進(jìn)行的高通量測序技術(shù)[1]．在先前的研究中，常常認(rèn)為生物體同一組織中的群體細(xì)胞具有相同功能．然而，組織細(xì)胞間的異質(zhì)性導(dǎo)致了同型細(xì)胞在基因功能和表達(dá)之間存在不同程度的差異．傳統(tǒng)的測序技術(shù)只能檢測生物體群體細(xì)胞的整體表達(dá)水平，而非單個細(xì)胞水平．隨著單細(xì)胞測序的出現(xiàn)，在單細(xì)胞水平上分析同型細(xì)胞基因功能與表達(dá)之間的差異性成為可能．

近年來，單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展日趨完善，實(shí)現(xiàn)了對單個細(xì)胞內(nèi)的基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學(xué)以及基因組和轉(zhuǎn)錄組的平行測序，其中，以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用最為廣泛．以單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序?yàn)槔?，其大致流程包括：分離單細(xì)胞(通常包括將組織酶解成細(xì)胞懸液)；分離后的單個細(xì)胞被裂解，細(xì)胞內(nèi)的RNA分子被捕獲并通過逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增；基因序列測序；對測序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通常包括數(shù)據(jù)批量處理、結(jié)果校正、降維和聚類等分析方法[2]．2012年，美國Science雜志成功預(yù)測了單細(xì)胞研究將成為2013年6大重點(diǎn)研究之首[3-5]．盡管單細(xì)胞分析是一項(xiàng)相對較新的技術(shù)，但通過高通量測序進(jìn)行的單細(xì)胞組學(xué)分析已經(jīng)應(yīng)用于數(shù)百項(xiàng)研究中，并取得了令人興奮的新生物學(xué)發(fā)現(xiàn)[6-9]．單細(xì)胞測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用在發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、傳染病學(xué)、免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域[10-12]．

1 單細(xì)胞分離技術(shù)

從生物個體或組織中分離單個細(xì)胞是進(jìn)行單細(xì)胞測序的第一步，也是最為重要的一步．但是單細(xì)胞的分離仍然具有較大難度，主要表現(xiàn)在所分離單細(xì)胞的完整性和純度、單細(xì)胞分離的通量和靈敏度．在實(shí)際操作中，常用的單細(xì)胞分離方法主要有以下5種(表1)．

表1 常用的單細(xì)胞分離方法

2 單細(xì)胞測序技術(shù)

2.1 單細(xì)胞基因組測序

單細(xì)胞基因組測序技術(shù)(single cell genome sequencing)指在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)新技術(shù)．主要是將分離的單細(xì)胞全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得高覆蓋率的完整基因組，通過高通量測序揭示群體細(xì)胞與單個細(xì)胞之間的差異性．

單個細(xì)胞所含DNA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于任何測序技術(shù)的核酸量，僅為皮克水平，因此，在進(jìn)行單細(xì)胞基因組測序前要對單細(xì)胞進(jìn)行裂解，再進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增．目前，單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)中，應(yīng)用較為廣泛的有基于熱循環(huán)的簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增技術(shù)(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)[18]、基于等溫反應(yīng)的多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple displacement amplification，MDA)[19]和多重退火環(huán)狀擴(kuò)增循環(huán)技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)[20]．其中，最為領(lǐng)先的是MALBAC，該技術(shù)在擴(kuò)增覆蓋率、均一性及靈敏度方面，均有很大提高[21]．MALBAC能夠降低PCR擴(kuò)增偏倚，使得單細(xì)胞93%的基因組能夠被檢測[22]．同時，該技術(shù)靈敏度高，對基因組DNA起始量要求較低，0.5 pg即可進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增均勻性明顯優(yōu)于其他技術(shù)．在單細(xì)胞基因組測序中出現(xiàn)噪音和覆蓋度較低或覆蓋度不完全時，可以通過檢測更多單細(xì)胞分析細(xì)胞之間的異質(zhì)性．

2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(single cell transcriptome sequencing，scRNA-seq)通常被稱為單細(xì)胞RNA測序.該技術(shù)通過分離單個細(xì)胞，捕獲它們的轉(zhuǎn)錄本，并生成轉(zhuǎn)錄本映射到單個細(xì)胞的測序庫，從而評估細(xì)胞群體和生物系統(tǒng)的基本生物學(xué)特性[23]．scRNA-seq可以在單細(xì)胞水平分析基因表達(dá)情況，其差異分辨率顯著高于批量轉(zhuǎn)錄組測序，這極大推動了轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展[24]．例如，scRNA-seq可用于識別和表征不同免疫細(xì)胞亞群的狀態(tài)，這些免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征使得識別新的致病因子和確認(rèn)生物標(biāo)志物成為可能[25-26]．scRNA-seq還可用于重建發(fā)育“軌跡”，揭示不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞命運(yùn)決定[27]．

目前，常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)主要有Smart擴(kuò)增技術(shù)(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)[28]、具有分子標(biāo)簽功能的10×Genomics技術(shù)[29]和線性擴(kuò)增的CEL-seq和CEL-seq2[30]等．其中,Smart-seq和Smart-seq2不僅可以檢測每個外顯子的表達(dá)情況，還能夠?qū)Λ@取的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行選擇性剪切分析[31-32]．10×Genomics極大地解決了組織群體細(xì)胞異質(zhì)性問題，并且有助于新細(xì)胞類型的發(fā)現(xiàn)[29]．最新發(fā)表的多重退火技術(shù)[20]和基于dC尾的定量單細(xì)胞RNA測序技術(shù)(MATQ-seq)[33]，可以檢測相同類型單個細(xì)胞之間極小的基因表達(dá)差異，并且通過提高逆轉(zhuǎn)錄效率增加其靈敏度．

2.3 單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測序

生物個體的基本遺傳信息儲存在核酸中，4種脫氧核苷酸的排列順序決定了核酸和蛋白質(zhì)的序列．表觀遺傳是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)并使其產(chǎn)生可遺傳的改變，包括組蛋白修飾、RNA干擾、DNA甲基化和染色質(zhì)重塑等[34]．通過在單細(xì)胞水平檢測全基因組的甲基化水平發(fā)掘高異質(zhì)性細(xì)胞表觀遺傳信息，為探究癌癥等疾病的發(fā)病機(jī)制[31]和胚胎分化機(jī)制提供了重要依據(jù)[35-36]．目前，單細(xì)胞表觀遺傳學(xué)測序方法主要有單細(xì)胞亞硫酸氫鹽測序法(single-cell bisulfite sequencing，scBS-seq)[37]、單細(xì)胞簡化代表性重亞硫酸鹽測序法(single-cell reduced-representation bisulfate sequencing，scRRBS)[38]和三維基因組測序法(high-through chromosome conformation capture，Hi-C)[39]．

2.4 單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測序

2015年4月27日，NatureMethods雜志上發(fā)布了一項(xiàng)備受矚目的技術(shù)——單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組平行測序技術(shù)(genome and transcriptome sequencing，G&T-Seq)[40]．該技術(shù)能夠在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的DNA和RNA平行測序，揭示單個細(xì)胞遺傳信息的改變與基因功能之間的關(guān)系[41]．G&T-Seq整合的重要意義在于能夠定性且定量地獲取單個細(xì)胞中基因組和轉(zhuǎn)錄組的所有信息，同時分析單細(xì)胞基因型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，深刻揭示單個細(xì)胞內(nèi)遺傳信息指導(dǎo)細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控機(jī)制．目前，G&T-Seq主要應(yīng)用在癌癥研究領(lǐng)域，尤其是循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，并且在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞多能性、細(xì)胞分化、細(xì)胞治療以及CRISPR/Cas基因編輯等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[42-43]．

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用

隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，極大推動了生命科學(xué)領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)，其中，寄生蟲學(xué)研究領(lǐng)域也受益頗多．利用單細(xì)胞測序技術(shù)，可以在單細(xì)胞水平上探究寄生蟲與宿主細(xì)胞之間的相互關(guān)系,檢測和鑒定新的寄生蟲物種，在單細(xì)胞水平上揭示不同類型細(xì)胞對寄生蟲生命周期的影響以及寄生蟲引起的宿主免疫應(yīng)答等．下面將主要介紹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用(圖1)．

圖1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序在寄生蟲學(xué)研究中的應(yīng)用Fig.1 Application of single cell transcriptome sequencing in parasitology

3.1 在蟲種鑒定和生長代謝機(jī)制方面的應(yīng)用

在單細(xì)胞測序還未得到廣泛應(yīng)用之前，定義寄生蟲的組織或細(xì)胞類型很大程度上只能局限于形態(tài)學(xué)特征，很難破譯其基因結(jié)構(gòu)；而通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)則可以獲得單個細(xì)胞的靶序列，并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析．

在瘧疾傳播方面，處于紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)育期(IDC)的瘧原蟲停止無性繁殖，轉(zhuǎn)化為配子體的形式存在．Ngara等[44]開發(fā)了基于毛細(xì)管內(nèi)單個受感染紅細(xì)胞(iRBCs)的分離平臺，并與scRNA-seq相結(jié)合，對瘧原蟲處于IDC的165個iRBCs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析．在IDC期間，通過對單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析將細(xì)胞分為多種轉(zhuǎn)錄狀態(tài)．有趣的是，從單個的iRBC分析中發(fā)現(xiàn)了一個基因標(biāo)記分子，它可以成功地在細(xì)胞水平上區(qū)分無性階段和有性階段的寄生蟲，繼而驗(yàn)證了以前未定義的配子細(xì)胞階段特異性基因．Poran等[45]發(fā)現(xiàn)scRNA-seq可區(qū)分惡性瘧原蟲的生命周期階段，并捕獲了細(xì)胞分化和細(xì)胞周期相關(guān)的一些關(guān)鍵事件．雖然細(xì)胞特異性功能和基因表達(dá)分析受到了缺乏可用標(biāo)記分子的限制，但通過高通量單細(xì)胞測序技術(shù)，提供了各種類型的細(xì)胞、組織或者有機(jī)體的基因表達(dá)情況[46-47]，并已經(jīng)被用于三腸渦蟲、扁形蟲、地中海圓頭渦蟲等寄生蟲的高分辨率細(xì)胞圖譜的繪制研究中[48]．

由此可見，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在分離寄生蟲整個生命周期的所有表型及其多個生命周期階段細(xì)胞圖譜的開發(fā)方面提供了極大助力，這將擴(kuò)展我們對寄生蟲細(xì)胞類型多樣性的現(xiàn)有理解，并為疫苗和藥物開發(fā)提供新的候選靶標(biāo)．

3.2 在生長周期和免疫逃逸機(jī)制方面的應(yīng)用

病原體入侵宿主后，通過多種致病機(jī)制損傷宿主．與此同時，病原體為維持其在宿主體內(nèi)的生存繁殖，需要通過各種方式逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊．瘧原蟲有一個復(fù)雜的生命周期，包括許多不同的發(fā)育階段，同時在宿主中積極逃避宿主免疫．通過微陣列數(shù)據(jù)集[49]以及scRNA-seq數(shù)據(jù)集[50]的使用，以2 h為間隔檢測24 h，包括以下發(fā)育時期：環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、未成熟裂殖體、成熟裂殖體以及雌、雄配子體等．scRNA-seq可以檢測不同生殖階段的群體細(xì)胞，通過偽時間分析確定生長周期中不同細(xì)胞的發(fā)展順序[51]．然而，也有一些基因是獨(dú)立于細(xì)胞周期而變化的，它們主要存在于亞端粒區(qū)域[52]．

Reid等[53]建立了一種適用于瘧原蟲scRNA-seq的新方法，不僅可以區(qū)分不同的細(xì)胞類群，還可以探索細(xì)胞與細(xì)胞之間潛在的功能差異，揭示了在傳播階段的不同性別差異表達(dá)的基因家族，它們通常是與逃避宿主免疫和發(fā)病機(jī)制相關(guān)的．在惡性瘧原蟲中，var基因家族是通過細(xì)胞黏附和抗原變異建立慢性感染的關(guān)鍵[54]，在雄性中沒有發(fā)現(xiàn)明顯變異，而在雌性中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄變異．在無性寄生蟲中，2種不同的非編碼var轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)是常見的，并參與維持相互排斥的var基因表達(dá)，這對它們的免疫逃避作用至關(guān)重要[55-56]．因此，scRNA-seq還可以為基因家族中互斥表達(dá)基因成員之間的相關(guān)轉(zhuǎn)錄事件提供新見解，如巴貝斯尼亞牛的ves基因家族和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的vsp基因家族[57]等．

3.3 在宿主免疫應(yīng)答方面的應(yīng)用

先前研究的是宿主的群體細(xì)胞對寄生蟲的免疫應(yīng)答，而通過scRNA-seq還能夠揭示宿主免疫細(xì)胞應(yīng)答時的群體細(xì)胞差異性，并進(jìn)一步探究其免疫應(yīng)答時的分子機(jī)制．細(xì)胞內(nèi)寄生蟲通過控制宿主細(xì)胞的免疫機(jī)制以啟動和維持感染．傳統(tǒng)批量獲得的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)掩蓋了寄生蟲和宿主細(xì)胞之間相互作用的異質(zhì)性，這些相互作用取決于宿主對感染反應(yīng)的應(yīng)答、宿主細(xì)胞類型、感染類型、組織組成等．Fontana等[58]發(fā)現(xiàn)了在CD4陽性T細(xì)胞中，編碼巨噬細(xì)胞刺激因子(MCSF)的基因Csfl在一類T細(xì)胞亞群中高表達(dá)；感染過程中CD4陽性T細(xì)胞Csfl的選擇性缺失，降低了某些骨髓亞群增殖和活化的能力.其中，最顯著的是淋巴結(jié)CD169陽性巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致感染寄生蟲的小鼠恢復(fù)受損．感染過程中CD169陽性巨噬細(xì)胞的減少也導(dǎo)致寄生蟲噬血癥增加和宿主死亡率升高．總的來說，在單個細(xì)胞水平上捕獲病原體和宿主轉(zhuǎn)錄本的動態(tài)變化對于探究不同感染狀態(tài)之間的關(guān)系非常重要．

最近的研究成功證實(shí)scRNA-seq能夠同時捕獲病毒[59]或細(xì)菌[60]與宿主的轉(zhuǎn)錄本．雖然宿主-細(xì)菌雙測序需要捕獲非聚腺苷酸轉(zhuǎn)錄本，但細(xì)胞內(nèi)寄生蟲感染宿主-病原體scRNA-seq聯(lián)合應(yīng)用是可行的，而且?guī)缀鯖]有技術(shù)障礙．Swierzy等[61]通過單細(xì)胞高通量測序，繪制了受弓形蟲菌株感染前后的小鼠細(xì)胞表達(dá)譜，通過對小鼠皮層神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等差異表達(dá)基因分析鑒定，發(fā)現(xiàn)弓形蟲與其宿主不同類型的細(xì)胞之間存在特異性反應(yīng)．因此推測，不同宿主類型的細(xì)胞的異質(zhì)表達(dá)以及寄生蟲對它們的適應(yīng)能力可能干預(yù)著寄生蟲-宿主的相互作用．

4 小結(jié)與展望

單細(xì)胞測序廣泛應(yīng)用于個體發(fā)育、生理代謝、疾病治療等方面．但是該技術(shù)仍處在不斷發(fā)展的階段，還有許多問題需要改進(jìn)：①在分離單細(xì)胞時，首先要保證單細(xì)胞的完整性，避免在分離細(xì)胞時可能發(fā)生的細(xì)胞交叉污染等問題，才能保證測序結(jié)果的可靠性與數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；②在測序過程中，核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增效率和信噪比等方面需要進(jìn)行不斷優(yōu)化和改進(jìn)；③在scRNA-seq分析中數(shù)據(jù)歸一化和聚類分析領(lǐng)域的研究仍不完善；④相比其他技術(shù)，單細(xì)胞測序技術(shù)的成本還相對很高，限制了其在臨床檢測、腫瘤研究等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用．相信隨著單細(xì)胞分離技術(shù)、測序技術(shù)、生物信息處理技術(shù)等環(huán)節(jié)的日臻完善，越來越多關(guān)于寄生蟲學(xué)的新認(rèn)識和新見解將會不斷涌現(xiàn)，并為該研究領(lǐng)域的拓展和深入帶來巨大變革.