滾環(huán)擴(kuò)增介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉 巨，梁濤波，許恒毅

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330047)

近年來，基于分子生物學(xué)的檢測(cè)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域，其中包括PCR(Polymerase chain reaction)技術(shù)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)技術(shù)等。RCA作為一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，因其具有高效、高保真性、高靈敏度以及能夠與各種常見信號(hào)輸出方法相結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)得到了較多關(guān)注，并在單核苷酸多態(tài)性(SNP)[1]、microRNAs(miRNAs)[2]、酶活性[3]以及病原微生物[4-5]檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[6]。本文重點(diǎn)闡述了基于RCA結(jié)合熒光、比色以及電化學(xué)信號(hào)輸出方式的傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用，綜述了RCA技術(shù)在生物傳感器領(lǐng)域的研究和應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)其存在的問題和發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 RCA技術(shù)的原理及類型

1.1 RCA技術(shù)的原理

自然界中，某些生物(如細(xì)菌、噬菌體等)體內(nèi)會(huì)發(fā)生環(huán)狀DNA或RNA分子的滾環(huán)復(fù)制過程，以此獲得相應(yīng)的DNA或RNA拷貝，RCA就是借鑒這種滾環(huán)擴(kuò)增方式發(fā)展的一種體外等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[7]。RCA技術(shù)始于上世紀(jì)90年代中期，已有研究表明，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下，約幾十個(gè)堿基的單鏈環(huán)狀DNA分子可作為DNA合成的模板，產(chǎn)生與環(huán)狀模板互補(bǔ)的具有重復(fù)串聯(lián)序列的單鏈DNA分子，產(chǎn)物大小約數(shù)百至數(shù)萬堿基，長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百納米至微米之間，證實(shí)了滾環(huán)擴(kuò)增在體外發(fā)生的可行性[8]。RCA反應(yīng)需要4個(gè)組分：①環(huán)狀DNA模板，稱為RCA模板；②與RCA模板部分互補(bǔ)的DNA/RNA引發(fā)鏈；③具有鏈置換活性的DNA/RNA聚合酶(如Phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Ventexo-DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶)；④脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。RCA模板通常是一條15～200個(gè)堿基的單鏈DNA分子，在DNA連接酶(如T4 DNA連接酶或Taq DNA 連接酶)和一條與模板的5’端和3’端部分互補(bǔ)的單鏈引物的作用下，模板DNA的5’磷酸端(5’-P)與3’羥基端(3’-OH)連接環(huán)化，以形成的環(huán)狀模板用于后續(xù)擴(kuò)增[9]。環(huán)狀模板的擴(kuò)增依賴于具有鏈置換和持續(xù)合成活性的DNA聚合酶，以Phi29 DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶最為常用。其中，Phi29 DNA聚合酶來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)噬菌體phi29，其相對(duì)分子質(zhì)量為66 kDa[10]。在其最適溫度30 ℃左右，Phi29 DNA聚合酶具有強(qiáng)大的5’-3’聚合活性和3’-5’外切酶活性，在20 min內(nèi)可產(chǎn)生大于70 kbp的擴(kuò)增子，其擴(kuò)增靈敏度可達(dá)到單分子拷貝，且由于其具有3’-5’外切酶活性，能夠?qū)铣傻膯捂溞蛄羞M(jìn)行校對(duì)，保真度較高[11]。Bst DNA聚合酶編碼基因含有來自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶的基因和外源的麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltoes-binding protein,MBP)基因，通過體外表達(dá)得到具有5’-3’聚合活性，但無3’-5’外切酶活性的Bst DNA聚合酶[12]。相比于Phi29 DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶具有更高的熱穩(wěn)定性和更強(qiáng)的持續(xù)合成能力同樣被廣泛應(yīng)用于LAMP和RCA實(shí)驗(yàn)，但因?yàn)槿狈?’-5’外切酶活性，其保真度較Phi29 DNA聚合酶略低。

1.2 RCA技術(shù)的類型

在進(jìn)行RCA實(shí)驗(yàn)之前，通常需要先獲得一條環(huán)狀的RCA模板。根據(jù)RCA模板環(huán)化方式的不同，可將其分為鎖式DNA(Padlock DNA)環(huán)化、啞鈴DNA(Dumbbell DNA)環(huán)化以及類啞鈴DNA(Dumbbell-like DNA)環(huán)化3種類型(如圖1A)[13-14]。通過在一條DNA鏈或兩條DNA鏈內(nèi)形成局部雙鏈的結(jié)構(gòu)，在T4 DNA連接酶或Taq DNA連接酶的作用下催化連接雙鏈DNA中單鏈切口的5’和3’兩末端，或者催化連接兩條雙鏈DNA片段的5’和3’兩末端，形成環(huán)狀的DNA分子[15]。在RCA實(shí)驗(yàn)中，RCA模板的環(huán)化是進(jìn)行后續(xù)RCA的重要步驟，通過預(yù)先設(shè)計(jì)，RCA體系中的環(huán)化步驟能夠作為識(shí)別組件，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別。

圖1 常見RCA模板環(huán)化方式及RCA擴(kuò)增方式Fig.1 Common circularization and amplification methods of RCA A:common circularization methods of RCA,(1) padlock DNA;(2) dumbbell DNA;(3) dumbbell-like DNA.B:common amplification methods of RCA,(a) single-primer RCA;(2) multi-primers RCA;(c) exponential RCA.C:signal output step of RCA,SG dye=SYBR Green dye(A：常見RCA模板環(huán)化方式,(1)鎖式DNA環(huán)化；(2)啞鈴DNA環(huán)化；(3)類啞鈴DNA環(huán)化。B：常見RCA擴(kuò)增方式，(a)單引物RCA；(b)多引物RCA；(c)指數(shù)RCA。C：RCA實(shí)驗(yàn)的信號(hào)輸出步驟，SG dye=SYBR Green dye)

RCA技術(shù)可大致分為單引物RCA(Single-primer RCA)、多引物RCA(Multi-primers RCA)和指數(shù)RCA(Exponential RCA)，如圖1B。單引物RCA也稱線性RCA，是指單一引物作為引發(fā)鏈，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，引發(fā)鏈沿環(huán)狀的RCA模板延伸，上游產(chǎn)物則在延伸過程中被反復(fù)置換，以此產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的具有串聯(lián)重復(fù)序列的單鏈DNA分子[6]。這種延伸在dNTPs充足的條件下可以不斷進(jìn)行，產(chǎn)生長(zhǎng)度是模板幾百或幾千倍的單鏈DNA拷貝[16]。多引物RCA則是在線性RCA原理的基礎(chǔ)上，額外加入一條或多條僅與環(huán)狀模板序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈引物作為引發(fā)鏈，即在滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中，環(huán)狀模板可與多對(duì)引物結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物被DNA聚合酶不斷置換，產(chǎn)生多條RCA產(chǎn)物，提高了環(huán)狀模板的利用效率，其擴(kuò)增效率是線性RCA的數(shù)倍[2]。指數(shù)RCA，也稱超分支RCA(Hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)，指通過在線性RCA體系中額外加入多對(duì)引物，這些引物既能和線性RCA產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合并延伸，延伸得到的DNA鏈又可與另一條次級(jí)引物結(jié)合，實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，產(chǎn)生大量長(zhǎng)短不一的單鏈及雙鏈產(chǎn)物，擴(kuò)增效率大大提高，因此被廣泛應(yīng)用于各種對(duì)靈敏度要求較高的檢測(cè)傳感器[8,17]。圖1C為RCA信號(hào)的輸出方式示例。

2 基于RCA的生物傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用

RCA技術(shù)因其擴(kuò)增快速、模板序列可設(shè)計(jì)、擴(kuò)增子分子量大以及保真度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DNA克隆、基因組分析、DNA納米結(jié)構(gòu)構(gòu)建以及生物傳感器等領(lǐng)域[18]。本文重點(diǎn)介紹基于RCA的生物傳感器在生物檢測(cè)中的應(yīng)用。RCA作為一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，可與多種信號(hào)輸出方式相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的熒光、比色或電化學(xué)檢測(cè)。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室探討并建立了基于RCA的熒光及比色傳感器用于檢測(cè)食源性致病菌[19-20]，所研究的傳感器利用不對(duì)稱PCR(Asymmetric PCR)或核酸適配子實(shí)現(xiàn)了“菌體-單鏈DNA”的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并利用RCA產(chǎn)物形成能夠與特異性染料結(jié)合的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，所設(shè)計(jì)的兩種傳感器具有信噪比高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食源性致病菌的快速靈敏檢測(cè)。近年文獻(xiàn)報(bào)道的基于RCA介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用總結(jié)于表1。

表1 RCA介導(dǎo)的核酸信號(hào)放大策略在生物傳感器中的應(yīng)用Table 1 Application of the biosensors based on RCA nucleic acid signal amplification strategy in biological detection

2.1 基于RCA的熒光生物傳感器

熒光生物傳感器借助于熒光的增強(qiáng)、猝滅或者發(fā)射波長(zhǎng)的移動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光物質(zhì)的檢測(cè)。RCA產(chǎn)物(單鏈或雙鏈DNA)可以與各種核酸熒光染料(SYBR Green Ⅰ、SYBR Green Ⅱ等)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)。基于RCA的熒光生物傳感器具有靈敏度高的特點(diǎn)，但由于熒光易被猝滅的特性以及需要昂貴的檢測(cè)儀器，該技術(shù)并不利于即時(shí)檢測(cè)(Point-of-care testing，POCT)。Li等[1]采用鎖式探針對(duì)待檢DNA單鏈進(jìn)行特異性識(shí)別，預(yù)先設(shè)計(jì)的鎖式探針能與含有突變堿基的DNA單鏈特異性結(jié)合并在連接酶的作用下環(huán)化，投入的RCA引物可與得到的環(huán)狀模板結(jié)合，發(fā)生RCA。通過投入SYBR Green Ⅰ 對(duì)RCA的雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行染色，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的熒光檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.05 nmol/L。該方法利用鎖式探針實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性識(shí)別，再引入RCA對(duì)信號(hào)進(jìn)行放大，只需熒光讀數(shù)儀既可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的讀取。基于G-四鏈體(G-quadruplexes)結(jié)構(gòu)的RCA實(shí)驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類RCA實(shí)驗(yàn)。Li等[3]建立了一種檢測(cè)端粒酶的熒光傳感器，該傳感器利用端粒酶能夠延伸特定堿基序列的特性，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的端粒酶引物和鎖式探針。當(dāng)待檢物端粒酶存在時(shí)，鎖式探針的環(huán)化和后續(xù)的RCA才能成功進(jìn)行，在RCA產(chǎn)物上形成大量重復(fù)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，體系內(nèi)的Thioflavin T能夠與G-四鏈體特異性識(shí)別并使得自身熒光大大增強(qiáng)，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的熒光檢測(cè)，該方法的檢測(cè)限達(dá)到了單細(xì)胞水平。Lee等[21]設(shè)計(jì)了一種基于環(huán)狀探針和DNA/RNA復(fù)合引物檢測(cè)核糖核酸酶H(Ribonuclease H)的傳感器，核糖核酸酶H能夠特異性識(shí)別并水解復(fù)合引物中氨基修飾的RNA序列，從而暴露出引物3’羥基端，使得引物能夠引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增，該方法的檢測(cè)限為0.019 U/mL，線性范圍為0～1 U/mL，檢測(cè)時(shí)間<5 min。本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一種基于RCA的PCR-RCA熒光傳感器用于檢測(cè)克羅諾桿菌屬[19]，采用不對(duì)稱加尾PCR從克羅諾桿菌屬基因組DNA中擴(kuò)增得到帶有聚胸腺嘧啶(Poly-T)尾巴的單鏈DNA，再投入預(yù)先成環(huán)的啞鈴DNA，帶尾的單鏈DNA能夠與啞鈴DNA結(jié)合，引發(fā)RCA，在RCA產(chǎn)物上形成大量重復(fù)的G-四鏈體結(jié)構(gòu)，通過投入ThT與G-四鏈體結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)克羅諾桿菌屬的熒光檢測(cè)。該方法在純培養(yǎng)液中對(duì)克羅諾桿菌屬的檢測(cè)限為4.3×101CFU/mL，線性范圍為4.3×101～4.3×106CFU/mL，相比于直接采用非特異性的SYBR Green 染料對(duì)RCA產(chǎn)物進(jìn)行染色的方法，該方法的信噪比較高，檢測(cè)靈敏度得到了提高。

2.2 基于RCA的比色生物傳感器

比色生物傳感器信號(hào)來源于體系顏色的變化，與熒光傳感器相比，比色傳感器無需或只需較為簡(jiǎn)便的儀器即可實(shí)現(xiàn)信號(hào)讀取，因此廣泛應(yīng)用于即時(shí)或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但比色生物傳感器由于顏色讀取易受到基質(zhì)干擾，其靈敏度相較于熒光生物傳感器略低。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)了一種基于RCA和適配子的半固相比色傳感器[20]，該方法采用ELISA與RCA相結(jié)合，通過適配子特異性識(shí)別并結(jié)合待檢物單增李斯特菌細(xì)胞，暴露出來的單鏈DNA能夠與環(huán)狀探針特異性結(jié)合并發(fā)生RCA，得到大量能夠與修飾有辣根過氧化物激酶(Horseradish peroxidase，HRP)的DNA探針互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合位點(diǎn)，HRP催化體系中的TMB(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine)發(fā)生顯色反應(yīng)，通過裸眼或吸光度可測(cè)定相應(yīng)的比色結(jié)果。該方法利用了RCA原位生長(zhǎng)的特點(diǎn)與ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，其在純培養(yǎng)液中的檢測(cè)限為4.6×102CFU/mL。Hamidi等[23]建立了一種基于RCA的pH響應(yīng)的比色傳感器。由于RCA體系中的dNTP會(huì)隨擴(kuò)增不斷釋放產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物H+，通過向體系中加入pH指示劑酚紅，可指示其是否發(fā)生RCA，實(shí)現(xiàn)裸眼檢測(cè)。利用該方法對(duì)流感病毒H5N1進(jìn)行檢測(cè)，得到的檢測(cè)限為3.3 pmol/L，檢測(cè)時(shí)間僅需20 min。該實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中有較好的應(yīng)用前景。Gao等[24]通過在丙肝病毒抗體上修飾DNA單鏈作為引發(fā)RCA的引物，得到的RCA產(chǎn)物形成大量G-四鏈體結(jié)構(gòu)，體系中的Hemin與G-四鏈體形成具有催化活性的復(fù)合物，催化TMB顯色，實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)，其裸眼檢測(cè)限為0.998 pmol/L。該方法利用DNA修飾的抗體，實(shí)現(xiàn)了“病毒衣殼-單鏈DNA”的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過單鏈DNA引發(fā)RCA實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，具有較好的實(shí)際應(yīng)用前景。Hu等[26]利用金納米粒子聚集變色的原理，設(shè)計(jì)了一條鎖式探針與目標(biāo)miRNA進(jìn)行特異性識(shí)別并環(huán)化，環(huán)化的探針隨后發(fā)生RCA，產(chǎn)生大量長(zhǎng)的單鏈RCA產(chǎn)物，金納米探針上修飾的DNA鏈可與RCA產(chǎn)物互補(bǔ)配對(duì)，從而拉近探針之間的距離，引起顏色變化。該方法對(duì)let-7a的檢測(cè)限為0.3 pmol/L，檢測(cè)線性范圍為0.3 ～300 pmol/L。RCA擴(kuò)增產(chǎn)物既可與修飾有互補(bǔ)DNA的金納米探針結(jié)合，促進(jìn)金納米粒子的聚集，也可作為單鏈DNA抑制高濃度鹽離子環(huán)境下金納米粒子的聚集。

2.3 基于RCA的電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是一種將生物敏感元件如DNA、蛋白質(zhì)等與電化學(xué)換能器相結(jié)合的分析裝置，具有操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。RCA因其原位擴(kuò)增的特點(diǎn)，相較于其他分子擴(kuò)增技術(shù)更適合應(yīng)用在基于半固相或固相載體的檢測(cè)傳感器中。Shen等[29]采用適配子結(jié)合被抗體捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞并引發(fā)RCA，形成的大量DNA分子與鉬酸鹽反應(yīng)生成氧化鉬磷，并產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，該方法的檢測(cè)限達(dá)到了單細(xì)胞水平，檢測(cè)線性范圍為5 ～3×104cells/mL。Zhang等[30]建立了一種基于RCA介導(dǎo)的納米鈀電化學(xué)傳感器用于檢測(cè)miRNA，RCA產(chǎn)生的富G序列單鏈能夠作為模板介導(dǎo)鈀納米粒子的原位合成，從而產(chǎn)生電信號(hào)，應(yīng)用該方法檢測(cè)miRNA-21的檢測(cè)限為8.6 amol/L，線性范圍為50 amol/L～100 fmol/L。該方法利用RCA原位生長(zhǎng)的特點(diǎn)，以RCA產(chǎn)物為模板實(shí)現(xiàn)了鈀納米粒子的原位合成，其電信號(hào)得到了顯著增強(qiáng)。RCA技術(shù)具有模板可設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，少量的RCA模板通過擴(kuò)增可以得到大量具有特定功能的DNA序列，體現(xiàn)了RCA技術(shù)的簡(jiǎn)便性。Wang等[31]利用RCA產(chǎn)生大量具有催化活性的DNA walker酶，通過酶的催化剪切作用釋放金電極表面的信號(hào)分子，從而實(shí)現(xiàn)電化學(xué)信號(hào)輸出，該方法的檢測(cè)限達(dá)0.28 fmol/L，檢測(cè)線性范圍為1.0 fmol/L～1.0 nmol/L。Xie[32]等通過在金電極上修飾適配子實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物脂多糖的特異性識(shí)別，再通過投入負(fù)載有適配子和RCA引物的金納米粒子與識(shí)別的脂多糖形成夾心結(jié)構(gòu)，引物與體系中的環(huán)狀模板結(jié)合并引發(fā)RCA，得到的聚胸腺嘧啶(Poly-T)RCA產(chǎn)物可以作為模板，實(shí)現(xiàn)銅納米粒子的原位生長(zhǎng)，顯著增強(qiáng)了輸出的電阻抗信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了脂多糖的靈敏檢測(cè)。該方法的檢測(cè)限為4.8 fg/mL，線性范圍為0.01 pg/mL～100 ng/mL。

3 總結(jié)與展望

近年來，等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)因其等溫以及高效的特性，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域，而在多種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)中，LAMP技術(shù)和RCA技術(shù)得到了較多的關(guān)注。盡管LAMP技術(shù)具有反應(yīng)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但同樣也具有引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，對(duì)靶序列長(zhǎng)度要求較高(<300 bp)以及容易受到污染等缺點(diǎn)。相比于LAMP技術(shù)，RCA技術(shù)則具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，核酸原位生長(zhǎng)有利于設(shè)計(jì)基于半固相的生物檢測(cè)芯片以及適合高通量檢測(cè)等，被廣泛用于生物傳感器的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。RCA作為一種高效的核酸擴(kuò)增技術(shù)被廣為應(yīng)用的同時(shí)，依然存在一些問題有待研究和改進(jìn)：①在RCA擴(kuò)增之前，環(huán)狀模板只能通過鎖式探針、啞鈴DNA環(huán)化以及類啞鈴DNA環(huán)化的方式獲得，鎖式探針在環(huán)化過程中的特異性依賴于探針與互補(bǔ)鏈的結(jié)合，特異性不高、未成環(huán)的探針可能會(huì)提高背景信號(hào)，對(duì)檢測(cè)靈敏度造成很大影響；啞鈴DNA環(huán)化以及類啞鈴DNA環(huán)化方式雖然產(chǎn)生背景信號(hào)的可能性較小，但因其環(huán)化效率低，在環(huán)化過程中需要過量的核酸原料,顯著增加了實(shí)驗(yàn)成本；②RCA技術(shù)雖能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)核酸的恒溫?cái)U(kuò)增，但仍需要數(shù)小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，不利于進(jìn)一步應(yīng)用；③RCA實(shí)驗(yàn)需要昂貴的修飾探針和相關(guān)連接酶及聚合酶，檢測(cè)成本偏高。因此，RCA技術(shù)還需在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、時(shí)間成本以及經(jīng)濟(jì)成本方面進(jìn)行改進(jìn)。在建立基于RCA的檢測(cè)方法前，應(yīng)考慮不同的實(shí)際檢測(cè)情況，選擇最佳的成環(huán)方式；通過研究開發(fā)更為高效廉價(jià)的RCA聚合酶，進(jìn)一步縮短RCA反應(yīng)時(shí)間，是未來RCA技術(shù)的研究重點(diǎn)之一。此外，利用RCA技術(shù)構(gòu)建DNA納米結(jié)構(gòu)作為信號(hào)載體，如負(fù)載有信號(hào)探針的DNA納米花和納米管等，是RCA技術(shù)在生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的新方向，具有較好的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，RCA作為一種高效的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，必將得到更為廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。