產(chǎn)油酵母合成微生物油脂的研究現(xiàn)狀及展望

陳 琳，錢秀娟，章曉宇，章文明，信豐學(xué)，姜 岷

(南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

微生物在一定條件下合成并儲存于菌體內(nèi)的油脂稱為微生物油脂，其脂肪酸組成與植物油脂相似[1]。與植物油脂相比，微生物油脂具有不與民爭糧爭地、不受氣候和環(huán)境影響、培養(yǎng)周期短、不受場地限制、易實(shí)現(xiàn)連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)勢[2-3]。面對石化油料的短缺、以糧換油的矛盾和日益惡化的環(huán)境問題，通過微生物轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)油脂及其他相關(guān)代謝產(chǎn)品，部分替代化石資源，將是可持續(xù)發(fā)展的必然。

一般，將能夠合成并積累超過細(xì)胞干質(zhì)量20%油脂的微生物稱為產(chǎn)油微生物[4]。其中，產(chǎn)油酵母因其優(yōu)良性能受到較多關(guān)注。從19世紀(jì)90年代產(chǎn)油酵母菌被首次發(fā)現(xiàn)以來，已有約30種酵母被鑒定為產(chǎn)油酵母[5]，研究最多的主要是解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、油脂酵母(Lipomycesspecies)、黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis)、禾本紅酵母(Rhodotorulagraminis)、彎曲隱球菌(Cryptococcuscurvatus)、淺白隱球酵母(Cryptococcusalbidus)和圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)[9]。其中，部分產(chǎn)油酵母通過基因改造或在特定條件下培養(yǎng)，胞內(nèi)油脂積累量可超過細(xì)胞干質(zhì)量的60%，具有非常大的開發(fā)潛力。此外，解脂耶氏酵母[6]能很好地利用甘油、烷烴和脂肪酸等廢液，而彎曲隱球菌[7]可以耐受多種抑制物，具有廣譜的碳源利用能力。與其他產(chǎn)油微生物相比，產(chǎn)油酵母菌培養(yǎng)簡單、生物量大、油脂含量高、底物利用譜廣泛、工業(yè)化適應(yīng)性強(qiáng)，是微生物油脂生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。

1 產(chǎn)油酵母油脂積累機(jī)制

酵母油脂的合成分為從頭合成和非從頭合成兩種方式。從頭合成是指酵母利用葡萄糖、木糖等碳源直接合成油脂。非從頭合成是指一些油脂酵母，如解脂耶氏酵母能吸收環(huán)境中的烷烴、脂肪酸等疏水性物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化為油脂儲存起來。油脂從頭合成過程大體可分為以下4個環(huán)節(jié)：①乙酰-CoA的生成；②脂肪酸鏈的形成；③脂肪酸鏈的加長和去飽和；④甘油三酯等脂質(zhì)的合成。具體路徑如圖1所示。

IDH—異檸檬酸脫氫酶；ACL—ATP-檸檬酸裂解酶；ACC—乙酰-CoA 羧化酶； MDH—蘋果酸脫氫酶；ME—蘋果酸酶；CMT—檸檬酸-蘋果酸轉(zhuǎn)移酶；FAS Ⅱ complex—脂肪酸(FAS)合酶復(fù)合體；E—延長酶；DS—去飽和酶；GPAT—甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶； PAP—磷脂酸磷酸酶；LPAT—單?；视王；D(zhuǎn)移酶；DGAT—二?；视王；D(zhuǎn)移酶;3-PGA—3-磷酸甘油酯；G3P—甘油醛-3-磷酸；DHAP—二羥基丙酮；LPA—溶血磷脂酸；PA—磷脂酸；DAG—甘油二酯；TAG—甘油三酯圖1 產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化葡萄糖或甘油合成油脂路徑Fig.1 Pathways of oleaginous yeasts convert glucose or glycerol into lipid

葡萄糖在線粒體中生成乙酰-CoA，乙酰-CoA在乙酰輔酶A羧化酶(ACC)作用下不可逆地羧化生成丙二酸單酰-CoA，成為脂肪酸鏈合成的起始。丙二酸單酰-CoA在脂肪酸合酶復(fù)合體(FASⅡcomplex)催化下，與?；d體蛋白(ACP)結(jié)合，以丙二酸單酰-CoA為C2供體逐次產(chǎn)生增加2個碳原子的?；?ACP復(fù)合物。真核微生物的脂肪酸鏈長一般至C16(軟脂酸)時終止，接下來的延長和去飽和作用分別需要延長酶E和細(xì)胞色素b5的參與。在細(xì)菌以及所有真核微生物中，甘油三酯的合成通常采用磷脂酸途徑：甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD)將二羥丙酮磷酸還原為3-磷酸甘油或甘油，甘油也可以在甘油激酶(GK)作用下生成3-磷酸甘油，經(jīng)甘油酰?；姿徂D(zhuǎn)移酶(GPAT)?；饔蒙蓡熙８视土姿幔儆闪字崃姿崦?PAP)轉(zhuǎn)化生成甘油二酯，最終經(jīng)二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT)催化生成甘油三酯，儲存于胞內(nèi)。而二羥丙酮磷酸途徑一般只存在于酵母和哺乳動物細(xì)胞中。二羥丙酮脂?；姿徂D(zhuǎn)移酶(DHAPAT)將二羥丙酮磷酸?；?，利用脂酰二羥丙酮磷酸還原酶(DHAPD)將其轉(zhuǎn)化為單酰甘油磷酸(PA)。

2 產(chǎn)油酵母底盤的構(gòu)建

優(yōu)良的菌株是實(shí)現(xiàn)微生物油脂產(chǎn)業(yè)化的前提。工業(yè)生產(chǎn)菌株必須具備魯棒性及穩(wěn)定、高產(chǎn)等性質(zhì)，為了應(yīng)對目前微生物油脂生產(chǎn)底物成本高的瓶頸，產(chǎn)油菌株還需要擁有寬廣的碳源利用譜，耐受復(fù)雜底物中的各種抑制因子。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)T.cutaneum2.1374可以耐受木質(zhì)纖維素水解液中的各種抑制物，如甲酸、乙酰丙酸、糠醛、5-甲基糠醛和香草醛等，具有非常好的產(chǎn)油潛力。Sitepu等[9]對從土壤篩選出來的48株產(chǎn)油酵母進(jìn)行測試發(fā)現(xiàn)，一部分菌株可以利用木質(zhì)纖維素水解液中的多種碳源，一部分可以耐受水解液中的多種抑制物，但沒有一株菌株可以利用水解液中的全組分碳源，并且耐受所有的抑制物。因此還需要對潛力菌株進(jìn)行誘變篩選或基因改造以提高其油脂合成的經(jīng)濟(jì)性。通過適應(yīng)性進(jìn)化篩選獲得性能優(yōu)越的誘變菌株是代謝工程的常用手段。劉雅婷等[10]采用常壓室溫等離子體誘變處理R.glutinis，篩選得到的誘變株生物量達(dá)20.04 g/L，油脂含量為42%，油脂的合成能力較原始菌株得到顯著提升。

酵母的油脂合成過程已經(jīng)解析清楚，通過基因工程手段強(qiáng)化油脂合成路徑、阻斷油脂合成競爭性途徑和調(diào)控油脂合成相關(guān)模塊是提高酵母油脂合成的有效手段(圖2)。

紫色模塊代表油脂合成路徑的強(qiáng)化；灰色模塊代表油脂合成競爭性途徑的阻斷；橙色模塊代表油脂合成模塊調(diào)控圖2 酵母油脂合成基因強(qiáng)化途徑Fig.2 Enhanced pathway of yeast lipid synthesis in gene

乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)是直接參與油脂合成的關(guān)鍵限速酶，通過增加這幾個基因的表達(dá)量可以有效提高油脂的合成水平。Davis等[11]通過過量表達(dá)大腸桿菌自身的4個ACC，使菌體油脂含量提高6倍。Tai等[12]利用Y.lipolytica過量表達(dá)自身的ACC后油脂含量提高了2倍。TEF1啟動子強(qiáng)化Y.lipolytica自身的DGAT轉(zhuǎn)錄，再利用其轉(zhuǎn)錄水平提高了17倍，油脂含量提高了4倍。

在細(xì)胞發(fā)酵后期，胞內(nèi)糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)效率降低，無法即時補(bǔ)給細(xì)胞代謝所需的碳源，細(xì)胞則會消耗胞內(nèi)儲存的三酰甘油，用于一些生命物質(zhì)的合成。因此通過阻斷或削弱油脂的降解以及其他一些競爭路徑可以有效提高細(xì)胞油脂的積累量。微生物細(xì)胞內(nèi)與油脂累積競爭的途徑主要有脂肪酸的β-氧化、3-磷酸甘油到脂酰二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化和磷脂的合成。其中，β-氧化是脂肪酸降解的主要途徑，對細(xì)胞能量的供應(yīng)有重要作用。酯酰-CoA氧化酶(AOX)是β-氧化的關(guān)鍵酶，但該酶家族保守性差，在不同種屬間差別較大。Cao等[13]通過抑制過氧化酶體和線粒體中與β-氧化耦聯(lián)的乙酰-CoA轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)減弱了β-氧化途徑，提高了C.tropicalis胞內(nèi)油脂積累。Courchesne等[14]研究發(fā)現(xiàn)，部分抑制β-氧化路徑可增加細(xì)胞油脂含量，但完全缺失AOX則會影響細(xì)胞能量供給，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常生長。3-磷酸甘油是三酰甘油的基本骨架，它和二羥丙酮磷酸同為糖酵解過程中間產(chǎn)物且二者能相互轉(zhuǎn)化。Beopoulos等[15]敲除了負(fù)責(zé)3-磷酸甘油到二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶甘油-3-磷酸脫氫酶(GUT2)，增加了3-磷酸甘油庫量，最終酵母油脂含量提高了3倍，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步弱化β-氧化途徑使油脂的含量提高了4倍。Dulermo等[16]通過強(qiáng)化3-磷酸甘油的穿梭，同樣增加了3-磷酸甘油的積累量，耦合AOX的缺失使細(xì)胞油脂含量提高34%。胞內(nèi)磷脂與甘油酯的合成均以磷脂酸為底物，因此，減少磷脂的合成量能增加細(xì)胞甘油酯含量。

ATP-檸檬酸裂解酶(ACL)和蘋果酸酶(ME)是產(chǎn)油微生物油脂合成代謝調(diào)控中的2個關(guān)鍵酶。ACL催化檸檬酸的裂解,提供油脂的合成的原料乙酰-CoA，它的活性直接影響產(chǎn)油微生物的油脂積累能力。Y.lipolytica中強(qiáng)化ACL的表達(dá)可以使脂肪酸的產(chǎn)量提升2倍[17]。Zhou等[18]發(fā)現(xiàn)小鼠的ACL可以顯著提高S.cerevisiae的生長和脂肪酸的合成。油脂的合成除了需要連續(xù)供給原料乙酰-CoA外，還需要提供足夠的輔因子NADPH，1分子乙酰-CoA參與脂肪酸鏈的延伸時需消耗2分子NADPH。雖然微生物體內(nèi)NADPH生成的過程很多,但脂肪酸合酶復(fù)合體幾乎只能利用由ME途徑產(chǎn)生的NADPH。如果ME受到抑制,則油脂積累下降，Li等[19]在R.glutinis中過量表達(dá)了來自卷枝毛霉的ME，重組菌株的油脂含量比野生型菌株提高了2倍。因此,有研究推測產(chǎn)油微生物中脂肪酸合酶復(fù)合體和ME等可能形成一個有機(jī)復(fù)合體——脂代謝體[20]。除了ME途徑提供的NADPH外，也有學(xué)者提出磷酸戊糖途徑中產(chǎn)生的NADPH參與了脂肪酸的合成，因?yàn)樵诋a(chǎn)油酵母Lypomycessp.中的ME是NAD+依賴型，而非NADP+[21]，且Y.lipolytica中發(fā)現(xiàn)油脂增加雖然伴隨ME酶活的提高，但最終的酶活檢測發(fā)現(xiàn)，酶活提高的ME主要位于線粒體[22]。另外磷酸戊糖途徑的碳流量的增強(qiáng)可以有效提高M(jìn).circinelloides油脂的合成水平[23]；也有推測胞質(zhì)中的異檸檬酸脫氫酶(ICDH)也為NADPH的供給做出了貢獻(xiàn)[24]。但目前，對于脂肪酸合成過程中還原性分子NADPH的來源還尚未研究清楚。

此外，轉(zhuǎn)錄因子TFs可以調(diào)節(jié)油脂合成途徑關(guān)鍵酶的水平和豐度。目前，S.cerevisiaeSNF2 轉(zhuǎn)錄因子研究相對清楚，它調(diào)控了磷脂合成，直接缺失SNF2可使油脂含量提高3.8倍[24]?？傮w而言，現(xiàn)階段對于產(chǎn)油微生物油脂積累代謝調(diào)控分子機(jī)制研究還不是很深入，許多調(diào)控機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

3 酵母油脂發(fā)酵過程強(qiáng)化

3.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

通過控制培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件是促進(jìn)油脂合成最常用的策略。培養(yǎng)基中氮源缺乏會導(dǎo)致線粒體中檸檬酸的累積，繼而轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，裂解生成乙酰-CoA，為脂肪酸的合成提供原料。因此，限制培養(yǎng)基中的氮源含量，即調(diào)節(jié)碳氮比(C/N)是油脂發(fā)酵中最常用的調(diào)控策略。產(chǎn)油酵母油脂積累的最佳C/N一般為50～150。C/N從24提高到72后，L.starkeyi的油脂積累量提高了1倍[25]。R.toruloides發(fā)酵產(chǎn)油脂的最優(yōu)C/N為120[26]，而T.cutaneum油脂積累的最適C/N為180[27]。但是C/N的調(diào)整有一定范圍，并非越大越好(圖3)。當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源受限時，細(xì)胞會調(diào)用胞內(nèi)儲存的油脂，將其轉(zhuǎn)化為其他生命物質(zhì)。除了限制氮源外，限制培養(yǎng)基中的磷元素或者硫元素也能調(diào)控油脂累積。例如，培養(yǎng)基中C/N恒定的情況下，碳磷比(C/P)從72增至95后，油脂的細(xì)胞含量由21%提高到了62%[28]。與限制磷元素類似，R.toruloides的油脂含量隨著碳硫比(C/S)的升高而升高[29]。磷元素和硫元素的缺乏導(dǎo)致細(xì)胞中核酸、蛋白和輔酶等生命物質(zhì)的合成受到抑制，從而影響了細(xì)胞增殖，菌體提早進(jìn)入油脂累積期。因此，磷限制和硫限制對于利用各種氮素豐富的粗原料生產(chǎn)油脂具有重要意義。

圖3 不同碳氮比對細(xì)胞生長及油脂合成的影響Fig.3 Effects of different C/N ratios on cell growth and lipid synthesis

油脂生產(chǎn)的最適pH隨微生物的種類不同而不同。通常酵母的最適pH為5.0～6.0[30]。油脂酵母的培養(yǎng)基初始pH偏中性更有利于油脂的積累，油脂合成的最適宜的溫度通常是25 ℃左右[31]，而且溫度的高低還會影響脂肪酸的組成：當(dāng)溫度降低時，油脂中棕櫚酸、油酸等含量增加；而當(dāng)溫度升高時，油脂的平均鏈長則會增長[32]。培養(yǎng)時間過短，菌體生物量不足，油脂含量低；培養(yǎng)時間太長，細(xì)胞會進(jìn)入衰亡期，形變自溶，增加了后期油脂提取的難度。此外，發(fā)酵體系的溶氧、接種量和種齡等對細(xì)胞的生長和油脂的積累都有重要影響[33]。

3.2 引入小分子調(diào)控

微生物根據(jù)細(xì)胞密度的變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控現(xiàn)象叫作微生物群體感應(yīng)，隨著細(xì)胞密度增加，信號分子的濃度相應(yīng)提高，并在臨界濃度時與特定的受體蛋白結(jié)合，激活其表達(dá)并誘導(dǎo)相應(yīng)目的基因表達(dá)，從而影響一系列生理生化特征。近年來，通過群體感應(yīng)分子調(diào)控微生物油脂合成的研究被陸續(xù)報(bào)道。例如，Kimura 等[34]發(fā)現(xiàn)20 mg/L的茴香腦、乙酰苯等香料成分能使L.starkeyi的油脂含量提高10%～46%。這種變化可能與其能夠誘導(dǎo)菌體形態(tài)變化有關(guān)[35]。武雙等[36]考察色醇對L.starkeyi產(chǎn)油能力的影響時，發(fā)現(xiàn)接種36 h后向培養(yǎng)基添加100 μmol/L的色醇，細(xì)胞的生物量和油脂量分別增加了7.4%和13.9%，且發(fā)酵時間縮短了13.3%。色醇是真核微生物進(jìn)行多細(xì)胞間相互聯(lián)系的信號分子，通過釋放與接收信號分子，微生物群體可同步、協(xié)調(diào)地應(yīng)對環(huán)境變換，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)代謝流分布。在釀酒酵母中，色醇是釀酒酵母穩(wěn)定期培養(yǎng)液中的主要成分，可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)菌體生長，在此過程中，主導(dǎo)菌體生長的基因表達(dá)量提高5倍。色醇還可以將影響形態(tài)變化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)機(jī)制結(jié)合起來[35]。

3.3 發(fā)酵模式的優(yōu)化及混菌發(fā)酵體系的構(gòu)建

當(dāng)前，微生物油脂生產(chǎn)以液態(tài)發(fā)酵為主，可以分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式方便控制限制因子濃度，獲得了廣泛應(yīng)用。C.curvatus采用分批補(bǔ)料發(fā)酵粗甘油合成油脂時，生物量超過30 g/L，油脂含量可達(dá)52%[37]。同樣，采用間歇補(bǔ)料發(fā)酵，R.toruloides油脂的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.36 g/(L·h)，而采用連續(xù)補(bǔ)料的方式時，其油脂生產(chǎn)強(qiáng)度提高到0.57 g/(L·h)[38]。為縮短發(fā)酵時間，提高油脂得率，林金濤等[39]提出了兩階段的培養(yǎng)模式：將菌體的增殖階段和產(chǎn)油階段分開，節(jié)省了氮源及其他輔料的消耗，提高油脂產(chǎn)量。另外，也有少量固體發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究，但油脂生產(chǎn)總體水平不高。

混菌培養(yǎng)通過將產(chǎn)物的合成路徑分模塊分工到幾個細(xì)胞中，不僅減輕了單個細(xì)胞的工作壓力，還可以實(shí)現(xiàn)廢棄資源的從頭利用。不同細(xì)胞間可以通過物質(zhì)、信號和能量的傳遞，促進(jìn)相互生長和代謝。目前研究最多的酵母油脂混菌生產(chǎn)系統(tǒng)是微藻-酵母，這種混菌系統(tǒng)有多種優(yōu)點(diǎn)：①酵母利用微藻光合作用產(chǎn)生的O2并提供CO2供微藻光合作用，平衡系統(tǒng)中的O2/CO2；②微藻可以吸收酵母發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機(jī)酸，降低環(huán)境酸性，平衡系統(tǒng)的pH；③酵母可以降解一些復(fù)雜的碳源供微藻直接利用。產(chǎn)油酵母R.glutinis和微藻C.vulgaris混菌發(fā)酵時，菌體生物量提升了5.7倍，油脂的產(chǎn)量提升了3.8倍[40]。共培養(yǎng)產(chǎn)油酵母T.spathulata和微藻Chlorellaspp，細(xì)胞的生物量和油脂含量都提升了1.6倍[41]。雖然微生物混菌培養(yǎng)成功應(yīng)用于多領(lǐng)域，但大多數(shù)混菌體系中菌株間的相互關(guān)系和作用機(jī)制研究尚不夠深入，對協(xié)同菌株的篩選缺乏有效的理論指導(dǎo)，對已經(jīng)應(yīng)用的混菌體系不能有效協(xié)調(diào)菌株關(guān)系，發(fā)揮最大效能[42]。因此，從生理、代謝和遺傳角度對混合菌間的關(guān)系進(jìn)行研究，以期得到更穩(wěn)定、更高效的混菌體系。

4 廉價(jià)底物的利用

原料成本高是限制微生物油脂產(chǎn)業(yè)普及和應(yīng)用的關(guān)鍵因素。目前，以葡萄糖和淀粉為原料制備微生物柴油的成本超過20 000 元/噸，其中原料成本占到總成本的60%～85%[43]。因而，拓展產(chǎn)油酵母的底物范圍，開發(fā)廉價(jià)易得的原料，是目前研究酵母油脂生產(chǎn)的熱點(diǎn)之一[44-45]。近年來，諸如木質(zhì)纖維素類原料、工業(yè)副產(chǎn)品、非糧糖質(zhì)原料以及工業(yè)廢水等已被廣泛用作微生物油脂的生產(chǎn)原料(表1)。

表1 利用廉價(jià)生物質(zhì)生產(chǎn)酵母油脂Table 1 Microbial lipid production from cheap carbon source by oleaginous yeast

4.1 木質(zhì)纖維素原料

木質(zhì)纖維素來源廣泛、可再生、價(jià)格低，被認(rèn)為是微生物油脂生產(chǎn)最理想的原料。木質(zhì)纖維素原料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三部分組成，經(jīng)過前處理后，可得到富含五碳糖和六碳糖的水解液，用于微生物培養(yǎng)。然而許多野生型酵母并不能直接利用五碳糖進(jìn)行發(fā)酵，或者五碳糖的利用效率很低。并且，利用含有葡萄糖的混合碳源發(fā)酵時，酵母往往優(yōu)先利用葡萄糖，只有當(dāng)葡萄糖降低到一定濃度以下，木糖的代謝才被啟動。提高油脂酵母對木糖的利用率對加快木質(zhì)纖維素工業(yè)煉制技術(shù)的進(jìn)程具有重要意義，而選育出能高效代謝木糖等五碳糖的產(chǎn)油菌株則是實(shí)現(xiàn)廉價(jià)生物質(zhì)生產(chǎn)微生物油脂的關(guān)鍵?？紫槔虻萚46]發(fā)現(xiàn)L.starkeyi利用木糖進(jìn)行發(fā)酵時的產(chǎn)油能力與葡萄糖相當(dāng)，并且可以同時轉(zhuǎn)化混合糖。以木糖作為碳源時，菌體的油脂含量達(dá)到52.6%；以葡萄糖和木糖的混合糖作為碳源時，菌體的油脂含量同樣達(dá)到了52.6%。Dai等[47]篩選到一株能同化木糖的R.glutinis，可以利用樹葉水解液累積占到菌體干質(zhì)量29%的油脂。

但是，木質(zhì)纖維素水解液中含有糠醛、酚類、乙酸和羥甲基糠醛等副產(chǎn)物，這些副產(chǎn)物的存在會嚴(yán)重影響酵母菌的生長和代謝，1 mmol/L的糠醛就能嚴(yán)重抑制R.toruloides菌體的生長與油脂的累積[47]。而且不同的副產(chǎn)物對產(chǎn)油酵母的影響非常復(fù)雜，當(dāng)多種副產(chǎn)物在水解液中并存時，毒性并不是簡單的累加。因此，在研究產(chǎn)油酵母利用木質(zhì)纖維素原料產(chǎn)油時，獲得能利用水解液中的多種碳源，且能耐受水解液中各種抑制因子的新型菌株非常重要。

目前，利用木質(zhì)纖維素制備微生物油脂取得了一系列進(jìn)展。然而囿于現(xiàn)階段技術(shù)水平，高效、綠色的前處理和優(yōu)良菌株的獲得仍是其規(guī)模化生產(chǎn)面臨的最大瓶頸，尚有許多更深入工作待開展。

4.2 工業(yè)副產(chǎn)品

在工業(yè)生產(chǎn)中往往會產(chǎn)生各種有機(jī)廢物。例如，乳清是歐美國家牛乳制備中的副產(chǎn)物，產(chǎn)量巨大，可作為微生物油脂生產(chǎn)的原料，Rhodococcussp.以乳清為碳源時可以合成45%～48%的油脂[48]。粗甘油是生物柴油生產(chǎn)的副產(chǎn)物，由于粗甘油中含有某些抑制因子，純化成本較高而被視為廢物丟棄。毋庸置疑，甘油將成為微生物油脂發(fā)酵的理想低成本的原料。Liang等[37]利用粗甘油培養(yǎng)C.curvatus，菌體油脂含量達(dá)到52%。甘油是Y.lipolytica的優(yōu)勢碳源，以其作為發(fā)酵底物，菌體的油脂含量可達(dá)到43.8%[49]。

4.3 非糧糖質(zhì)原料

甲殼質(zhì)類生物質(zhì)，木薯、菊芋等非糧糖質(zhì)原料，也是微生物油脂生產(chǎn)的良好原料來源。甲殼質(zhì)主要存在于節(jié)肢動物和軟體動物中，在自然界中儲量豐富，僅次于纖維素。甲殼質(zhì)的基本單位是乙酰葡萄糖胺，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也與纖維素相似，都是六碳糖的多聚體。甲殼質(zhì)水解后生成N-乙酰-D-葡糖胺和氨基葡萄糖。C.albidus、C.curvatus和T.fermentans等可以轉(zhuǎn)化N-乙酰-D-葡糖胺積累達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量28%以上的油脂[28,51]。

木薯在我國種植廣泛，價(jià)格低廉，水解后的主要產(chǎn)物是葡萄糖，是微生物發(fā)酵的理想原料。袁錦云等[50]利用T.cutaneumB3發(fā)酵木薯水解液，在2 L發(fā)酵罐中，菌體生物量、油脂含量和油脂產(chǎn)量分別達(dá)28.7 g/L、42.8%和12.27 g/L。

菊芋是一種多年生耐鹽，抗貧瘠，抗旱的高產(chǎn)高糖植物，可在灘涂地、鹽堿地生長，不占用耕地。發(fā)展菊芋生物質(zhì)生產(chǎn)微生物油脂對于降低油脂生產(chǎn)成本，改善生態(tài)環(huán)境，發(fā)展農(nóng)業(yè)等具有重大意義。Y.lipolytica、R.toruloides、R.mucilaginosa和T.cutaneum等都可以利用菊芋水解液生產(chǎn)油脂。

4.4 工業(yè)廢水

工業(yè)化和城市化進(jìn)程的加快導(dǎo)致工業(yè)廢水和城市廢水的排放量越來越大，環(huán)境污染也日趨嚴(yán)重。污水中含有大量的糖類物質(zhì)、有機(jī)酸等，開發(fā)污水作為廉價(jià)原料用于微生物發(fā)酵對于解決環(huán)境污染意義重大。Angerbauer等[52]利用城市廢水培養(yǎng)L.starkeyi，其油脂含量高達(dá)68%。Xue等[53]利用味精工業(yè)廢水培養(yǎng)R.glutinis生產(chǎn)微生物油脂，發(fā)酵體系已經(jīng)放大到300 L發(fā)酵罐的規(guī)模，表明味精廢水在產(chǎn)油微生物廉價(jià)底物的開發(fā)上具有巨大潛力。

5 微生物油脂聯(lián)產(chǎn)附加值產(chǎn)品的體系開發(fā)

根據(jù)生物煉制和綠色制造理念，原料經(jīng)油脂發(fā)酵轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的菌液和菌渣需要進(jìn)一步以“吃干榨盡”的方式轉(zhuǎn)化為多種產(chǎn)品。例如，可將油脂提取后的菌渣，用于蛋白飼料的生產(chǎn)；也可以從微生物油脂中分離高值產(chǎn)品，如多不飽和脂肪酸等。以油脂生產(chǎn)為主、附加值產(chǎn)品生產(chǎn)為輔的生產(chǎn)模式，不僅可以提高培養(yǎng)基中資源的利用，避免資源浪費(fèi)，還可以促進(jìn)高附加值產(chǎn)物的合成，提高油脂生產(chǎn)過程的經(jīng)濟(jì)性，是一個雙贏的策略。目前關(guān)于油脂聯(lián)產(chǎn)附加值產(chǎn)品主要集中在燃料物質(zhì)、蛋白質(zhì)、三羧酸循環(huán)中的有機(jī)酸、胞外多糖以及一些脂溶性產(chǎn)品(如類胡蘿卜色素、染料等)，或者通過基因編輯提高多不飽和脂肪酸的含量。Satari等[54]研究了Mucorindicus和Rhizopusoryzae共同利用消化柑橘廢棄物游離糖生產(chǎn)殼聚糖、油脂、蛋白質(zhì)和乙醇的能力，在氣升式反應(yīng)器中共培養(yǎng)兩種菌株時，Mucorindicus可以積累9.8%的油脂和36%的乙醇，Rhizopusoryzae可以積累4.4%的油脂和18%的乙醇。Zhang等[55]培養(yǎng)Rhodosporidiumtoruloides實(shí)現(xiàn)聯(lián)產(chǎn)0.69 mg/g類胡蘿卜素和0.41 g/g脂肪酸。

酵母菌自身的蛋白含量高達(dá)50%～60%，與大豆蛋白、蛋清蛋白等相比，酵母蛋白富含維生素B族元素、氨基酸等營養(yǎng)成分，部分酵母還可分泌促生長因子。酵母還具有生物量大、適應(yīng)性好、發(fā)酵過程無毒無害、易分離回收等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此酵母蛋白被公認(rèn)為是制備蛋白飼料的首選[56]。微生物油脂是典型胞內(nèi)產(chǎn)物，在生產(chǎn)過程中伴生大量菌渣，富含多糖、蛋白質(zhì)、微量元素以及其他營養(yǎng)物質(zhì)，因此產(chǎn)油酵母相比于其他常規(guī)酵母更具優(yōu)勢。開發(fā)產(chǎn)油酵母菌渣的剩余價(jià)值不僅可以緩解蛋白飼料的市場緊缺，而且更利于建設(shè)節(jié)約環(huán)保、健康友好型生態(tài)環(huán)境。王冬梅等[57]考察產(chǎn)油酵母發(fā)酵啤酒生產(chǎn)廢水生產(chǎn)油脂能力時發(fā)現(xiàn)，T.porosumD02和L.starkeyi1809的油脂產(chǎn)量、菌體粗蛋白產(chǎn)量分別達(dá)到了8.93、6.1和4.62、4.42 g/L。Mitra等[58]利用產(chǎn)油酵母M.circinelloides發(fā)酵酒糟水，菌體生物達(dá)到20 g/L，油脂和蛋白的胞內(nèi)含量分別為46%和30%。近年來，蛋白資源缺乏造成系列的問題日益顯著，通過微生物發(fā)酵制備菌體蛋白飼料具有良好的發(fā)展前景。

6 酵母油脂的研究瓶頸及未來發(fā)展方向

雖然發(fā)酵法生產(chǎn)酵母油脂在技術(shù)上已經(jīng)完全可行，然而昂貴的生產(chǎn)過程減緩了其產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。價(jià)值決定價(jià)格，微生物油脂的產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵看其經(jīng)濟(jì)效益。廉價(jià)底物，如木質(zhì)纖維素、非糧糖質(zhì)物質(zhì)、工業(yè)副產(chǎn)物及工業(yè)廢水的利用是降低酵母油脂生產(chǎn)成本的最直接手段。然而這些低劣底物往往組分復(fù)雜，且含有大量抑制菌株生長代謝的物質(zhì)，使得菌株很難有效地利用底物中的碳源氮源。為提高產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化低劣底物合成油脂的效率，不僅需要發(fā)展高效的底物處理技術(shù)，還需要篩選能夠利用和耐受不同抑制物、積累大量油脂的優(yōu)質(zhì)菌株，以擴(kuò)大產(chǎn)油酵母的底盤豐度。

提高微生物的油脂轉(zhuǎn)化率也是相當(dāng)關(guān)鍵的。需要加強(qiáng)酵母油脂的基礎(chǔ)研究，清晰認(rèn)識不同菌株油脂合成所涉及的代謝網(wǎng)絡(luò)、模塊、元器件以及油脂發(fā)酵調(diào)控機(jī)制，充分利用先進(jìn)的合成生物學(xué)技術(shù)手段，有目的地改造菌株，提高現(xiàn)有菌株的油脂轉(zhuǎn)化率。在此基礎(chǔ)上耦合發(fā)酵過程強(qiáng)化來提高油脂合成產(chǎn)量。在未來的發(fā)展中，開發(fā)酵母油脂生產(chǎn)的新工藝、新技術(shù)和新裝備，降低消耗、提高產(chǎn)率，對最終降低油脂的生產(chǎn)成本有重要意義。

高效清潔的油脂提取處理方法是另一重要的發(fā)展方向。從毒性、提取率和成本等方面出發(fā)，建立有利于微生物提取回收的加工方法，有著重要意義。此外，建立產(chǎn)油微生物共培養(yǎng)體系以提高對于低劣復(fù)雜底物的轉(zhuǎn)化效率，設(shè)計(jì)構(gòu)建酵母油脂聯(lián)產(chǎn)附加值化學(xué)品體系以提高油脂生產(chǎn)體系的經(jīng)濟(jì)性都為微生物油脂油的經(jīng)濟(jì)化生產(chǎn)提供了新的方向。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和合成生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，能源微生物油脂研究在生物煉制和綠色化學(xué)理念指導(dǎo)下，將持續(xù)改善過程的綜合技術(shù)經(jīng)濟(jì)性，最終為生物燃料的生產(chǎn)提供可靠技術(shù)。