糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM的克隆、表達(dá)及其在芹菜素糖基化修飾中的應(yīng)用

秦盼盼，周雨朦，何冰芳

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800；2. 南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046)

黃酮類化合物具有多種藥理活性，如抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、改善血液循環(huán)[3]和免疫調(diào)節(jié)等[4-5]。但其水溶性較差，生物利用度低，且酚羥基的存在導(dǎo)致部分黃酮類化合物穩(wěn)定性差，因此需要對黃酮類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以增加其水溶性和穩(wěn)定性[6]，如糖基化修飾[7-8]。糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)是專門催化一些底物進(jìn)行糖基化的酶[9]，可以將活性糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到黃酮類、萜類和甾體類等糖基受體形成糖苷等多種化合物。糖基轉(zhuǎn)移酶具有轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)快、條件溫和、選擇性好等特點(diǎn)[10]，糖基化底物范圍廣泛，但是轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)需要活化的糖基供體如尿苷二磷酸-葡萄糖(UDPG)，價(jià)格比較昂貴，在一定程度上限制了糖基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)際用途。如Noguchi等[11]以UDPG為糖基供體，用糖基轉(zhuǎn)移酶成功在兒茶素的4′位羥基引入糖基，得到(+)-兒茶素4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，產(chǎn)率達(dá)到83%。

蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuSy)在高等植物中廣泛存在，它能以蔗糖和尿苷二磷酸(UDP)為底物反應(yīng)生成果糖和UDPG[12-14]，UDPG可作為糖基轉(zhuǎn)移酶活化形式的糖基供體，因此利用糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶的耦聯(lián)可使反應(yīng)體系中的UDPG循環(huán)再生[15-17]。

本文中，筆者采用基于糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM-蔗糖合成酶SuSy雙酶耦聯(lián)體系(圖1)糖基化芹菜素，考察pH、溫度、DMSO濃度、底物摩爾比和加酶量對雙酶催化體系轉(zhuǎn)化率的影響，以期提高糖基化芹菜素產(chǎn)率。

圖1 糖基轉(zhuǎn)移酶和蔗糖合成酶的UDPG 再生催化芹菜素糖基化Fig.1 Schematic diagram of cyclic utilization of UDPG by glycosyltransferase and sucrose synthase for glycosylation of apigenin

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)、巨大芽孢桿菌、pET-28a(+)質(zhì)粒，筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏；蔗糖合成酶SuSy，本實(shí)驗(yàn)室從擬南芥來源、通過PTDS(PCR-based two-step DNA synthesis)策略全基因合成得到，構(gòu)建到菌株E.coliBL21(DE3)中。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用引物由南京思普金公司合成；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、15 000 DNA Marker、Premised Protein Marker(Low)和Genomic DNA Mini Preparation Kit，TaKaRa公司；芹菜素,南京澤朗植提技術(shù)有限公司。

DIONEX P680型高效液相色譜,Dionex公司；AKTATMPrimer蛋白純化系統(tǒng)，GE Healthcare公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽，Bio-Rad公司；Master cycler personal PCR儀，Eppendorf公司。

1.3 GTBM的克隆表達(dá)

以糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC為探針，以實(shí)驗(yàn)室耐有機(jī)溶劑菌庫為基礎(chǔ)，比較了菌庫中糖基轉(zhuǎn)移酶和Bs-YjiC位于PSPG motif關(guān)鍵序列，篩選出巨大芽孢桿菌。巨大芽孢桿菌基因組通過Genomic DNA Mini Preparation Kit提取得到，以基因組為模板，使用引物bmgt-F和bmgt-R進(jìn)行PCR反應(yīng)得到糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM的基因bmgt。以bmgt為模板，使用引物bmgt-SF和bmgt-SR進(jìn)行PCR反應(yīng)，并對其產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行NcoI和XhoI雙酶切處理，將上述處理過的載體和基因在T4 DNA連接酶作用下16 ℃過夜連接。最后將產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)成重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-bmgt，涂布于平板(含50 μg/mL Kana)，鑒定并篩選陽性克隆子。將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-bmgt接種到含有50 μg/mL Kana的LB(10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母浸提物、10 g/L NaCl)液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)作為種子液，按體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種至新鮮LB(含50 μg/mL Kana)液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中培養(yǎng)菌液至OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入終質(zhì)量濃度為3 g/L乳糖，降低溫度至20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)12 h。4 ℃、12 000 r/min離心后收集菌體，加入適量Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(PBS)(1/15 mol，pH 7.5)懸浮菌體，超聲破碎(200 W，超聲3 s，間隔5 s，15 min)，收集上清液即為粗酶液。加入等量PBS懸浮細(xì)胞碎片，得到酶的包涵體。參照文獻(xiàn)[18]的方法，對GTBM進(jìn)行Ni2+柱純化。引物序列為bmgt-F：A￣T￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣T￣T￣T￣T￣A￣A￣T￣G￣A￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣T，bmgt-R：T￣G￣A￣A￣T￣A￣T￣T￣G￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣T￣A￣C￣G￣T￣G￣A￣T￣T￣T，bmgt-SF：G￣T￣G￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣C￣A￣A￣A￣C￣A￣T￣T￣T￣T￣A￣A￣T￣G￣A￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣T，bmgt-SR：G￣T￣G￣C￣T￣C￣G￣A￣G￣T￣G￣A￣A￣T￣A￣T￣T￣G￣C￣T￣T￣C￣A￣C￣T￣A￣C￣G￣T￣G￣A￣T￣T￣T。

1.4 GTBM和SuSy活性測定

在1 mL的反應(yīng)體系中含終體積分?jǐn)?shù)5% DMSO、0.185 mmol芹菜素、0.37 mmol UDPG、1/15 mol PBS(pH 7.5)，35 ℃預(yù)熱20 min后，加入適量酶液啟動反應(yīng)，用1/15 mol PBS補(bǔ)至1 mL。反應(yīng)15 min后，吸取400 μL反應(yīng)液至600 μL甲醇中終止反應(yīng)，利用高效液相色譜法(HPLC)測定芹菜素衍生物生成的量。

GTBM酶活力的定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmol芹菜素衍生物所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

SuSy酶活力的定義：在pH 6.0下，每分鐘生成1 μmol果糖所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。酶活測定原理及方法參照文獻(xiàn)[19]。

1.5 GTBM的酶學(xué)性質(zhì)測定

為了考察GTBM的最適反應(yīng)pH，在底物中加入pH 5.0～8.0的PBS(1/15 mol/L)緩沖液和pH 7.5～10.0的Tris-HCl(1/20 mol/L)緩沖液，以最高酶活力為100%，測定各pH下的相對酶活力。為了考察GTBM的最適反應(yīng)溫度，在底物中加入適量最適pH緩沖液，預(yù)熱至不同溫度(20、25、30、35、40和45 ℃)，加入適量酶，以最高酶活力為100%，測定相對酶活力。為了考察GTBM對金屬離子和溶劑DMSO 的耐受性，在上述最適pH和溫度下，在底物中分別加入終濃度1 mmol/L和5 mmol/L的不同金屬離子(Ca2+、Ni2+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Ba2+和Fe3+)，將酶液分別與不同體積分?jǐn)?shù)(0、5%、 10%、15%、20%和25%)的DMSO混合，分別放置2 h和12 h后，分別以不加金屬離子的酶液酶活和初始酶活為100%，檢測相對酶活力。

1.6 雙酶耦聯(lián)反應(yīng)體系參數(shù)的優(yōu)化

在1 mL PBS(pH 7.5)反應(yīng)體系中加入終體積分?jǐn)?shù)為5%DMSO、1 mmol/L芹菜素、5 mmol/L蔗糖、0.05 mmol/L UDP、20 mU/mL GTBM、20 mU/mL SuSy，在恒溫反應(yīng)器上，先將底物預(yù)熱至35 ℃，轉(zhuǎn)速800 r/min，酶液最后添加，反應(yīng)3 h時(shí)取樣，重復(fù)3次。在SuSy添加量不變的前提下，依次考察pH、溫度、DMSO用量、蔗糖添加量、UDP添加量和GTBM添加量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響，并依次對其優(yōu)化。其中pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的1/20 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH為7.5、8.0、8.5、9.0的1/15 mol PBS緩沖液；溫度為20、25、30、35、40、45和50 ℃；DMSO用量為0%、5%、10%、15%、20%和25%；蔗糖濃度為1、5、10、20、30和50 mmol/L；UDP濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mmol/L；GTBM添加量為10、20、40、60、100和200 mU/mL。

1.7 芹菜素衍生物HPLC和質(zhì)譜分析

吸取400 μL反應(yīng)液至600 μL甲醇中終止反應(yīng)，色譜條件為TC-C18色譜柱，檢測波長340 nm[20]，流動相為V(甲醇)∶V(水)=60∶ 40，流速為1.0 mL/min。并進(jìn)一步對其產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜(MS)分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 GTBM的克隆表達(dá)

以糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC為序列比對模板，比較了幾種潛在糖基轉(zhuǎn)移酶和Bs-YjiC位于PSPG motif關(guān)鍵序列(圖2(a))，篩選出巨大芽孢桿菌來源的糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM。使用引物進(jìn)行PCR反應(yīng)后得到GTBM的基因，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見圖2(b)，對應(yīng)片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

在3 g/L乳糖、溫度20 ℃條件下，誘導(dǎo)12 h時(shí)，可得到較多的可溶性蛋白和較少的包涵體。進(jìn)一步對酶進(jìn)行了Ni2+柱純化，得到電泳純的糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM，結(jié)果見圖3。經(jīng)酶活測定，得到的GTBM純酶液比酶活為4.21 U/mg。

2.2 GTBM的酶學(xué)性質(zhì)

考察pH、溫度、金屬離子及DMSO對GTBM酶活的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知：當(dāng)pH在7.5時(shí)，其酶活達(dá)到最大，最適pH為7.5，在偏堿性緩沖中具有較大的酶活;在pH為7.0～8.5時(shí)，該酶表現(xiàn)出最大酶活力的80%以上。在相同pH的不同緩沖液中，其酶活也有略微差別。pH為7.5～8.0時(shí)，相同pH下，在Na2HPO4-KH2PO4中的GTBM活性略高于在Tris-HCl中的酶活，這與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)果基本一致。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA； 1— pET-28a(+)；2— bmgt的PCR產(chǎn)物圖2 GTBM和Bs-YjiC的PSPG序列比對及 GTBM的PCR克隆產(chǎn)物Fig.2 Comparison of PSPG of GTBM and Bs-YjiC(a)， and PCR amplification products of glycosyltransferase GTBM(b)

圖4 pH、溫度、金屬離子和DMSO對GTBM酶活力的影響Fig.4 Effects of pH,temperature,metal ionsand DMSO on enzyme activity of GTBM

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1— GTBM 粗提物；2— GTBM 純化物圖3 糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM的蛋白電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of GTBM

適當(dāng)升高溫度可以加快酶促反應(yīng)，但是反應(yīng)溫度過高，酶會變性失活。GTBM在20～35 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，其酶活力顯著增加；當(dāng)溫度超過35 ℃后，酶活力開始下降；在35 ℃時(shí)，酶活力最高，故該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的部分糖基轉(zhuǎn)移酶最適溫度在30～40 ℃相符。

與沒有加入金屬離子的酶活相比，1和5 mmol/L的Cu2+、Ni2+、Zn2+、Fe2+和Fe3+對GTBM酶活有不同程度的抑制作用，濃度越高抑制作用越大，與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的糖基轉(zhuǎn)移酶基本一致，Ca2+和Ba2+對酶活沒有明顯的影響。Mg2+對多數(shù)糖基轉(zhuǎn)移酶有一定的激活作用[23]，添加5 mmol/L Mg2+對GTBM的激活作用與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的一致。

Radu等[24]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌來源GT在體積分?jǐn)?shù)10%DMSO中酶活力只有初始酶活力的62.2%，而本文中，克隆表達(dá)的GTBM具有更高的DMSO耐受性，在0～15% DMSO中,其相對酶活仍保留初始酶活的80%以上，DMSO體積分?jǐn)?shù)大于20%時(shí)相對酶活為初始酶活力的70%，與文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道的糖基轉(zhuǎn)移酶在20% DMSO中只有40%～60%初始酶活相比，有著更強(qiáng)的DMSO耐受性。

2.3 雙酶耦聯(lián)反應(yīng)體系參數(shù)的優(yōu)化

為了測試糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM與蔗糖合成酶SuSy雙酶耦聯(lián)催化芹菜素糖基化的效果，分別考察pH、溫度、DMSO用量、蔗糖濃度、UDP濃度和GTBM酶液添加量對轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH、溫度、DMSO、蔗糖濃度、UDP濃度和GTBM添加量對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effects of pH,temperature,and DMSO concentration,sucrose,UDP and GTBM on the conversion rate

由圖5可知，當(dāng)pH從6增至7.5時(shí)，其轉(zhuǎn)化率逐漸增加，此后隨著pH的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸下降，當(dāng)在磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH為7.5時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大(約30%)。糖基轉(zhuǎn)移酶的最適pH一般都為7.5～8.0[21]，而蔗糖合成酶的最適pH一般都在6.0左右[23,25]。

而溫度對雙酶耦聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響相當(dāng)顯著，轉(zhuǎn)化率先是隨著溫度的升高而提高，在35 ℃達(dá)到最高，約35%。而后隨著溫度升高，轉(zhuǎn)化率下降。

常溫下，芹菜素在水中的溶解度極低，在酶催化芹菜素糖基化反應(yīng)體系中，加入適量有機(jī)溶劑DMSO，可以提高反應(yīng)體系中底物芹菜素的溶解性，與酶Bs-YjiC和OleD催化芹菜素糖基化的體系相比，芹菜素底物濃度分別提高了1倍和19倍。在DMSO體積分?jǐn)?shù)低于10%時(shí)，隨著DMSO量的增加，其轉(zhuǎn)化率也逐漸增高，在10%時(shí)達(dá)到最大值(約35%)；在DMSO體積分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)，其轉(zhuǎn)化率逐漸下降，在DMSO體積分?jǐn)?shù)為0時(shí)，其轉(zhuǎn)化率極低，這可能由于黃酮類化合物極其不溶于水，在水相中呈固體狀，難以快速反應(yīng)，故GTBM和SuSy在DMSO濃度為0時(shí)，催化芹菜素糖基化產(chǎn)率極低。

蔗糖濃度對雙酶耦聯(lián)轉(zhuǎn)化率的影響也相當(dāng)大，隨著蔗糖濃度的逐漸升高，芹菜素糖基化的產(chǎn)率也逐漸升高，當(dāng)蔗糖濃度為20 mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值約47%；繼續(xù)增加蔗糖濃度的量，轉(zhuǎn)化率不再升高。

UDP作為糖基轉(zhuǎn)移酶糖基化的副產(chǎn)物，過高濃度的UDP會抑制糖基轉(zhuǎn)移酶的活性[19]。當(dāng)UDP濃度從0.01增至0.1 mmol/L時(shí)，其轉(zhuǎn)化率逐漸升高；UDP濃度為0.1 mmol/L時(shí)芹菜素糖基化產(chǎn)率最高約55%，繼續(xù)增加UDP濃度，轉(zhuǎn)化率下降。

GTBM酶液添加量對雙酶體系反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響特別明顯。固定SuSy酶添加量為20 mU/mL的條件下，加入GTBM為60 mU/mL時(shí)，其糖基化產(chǎn)率達(dá)到最大值約90%；繼續(xù)增加GTBM的酶量，其產(chǎn)率不再增加。

進(jìn)一步考察雙酶耦聯(lián)糖基化芹菜素時(shí)間進(jìn)程曲線，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在pH 7.5和溫度35 ℃條件下，當(dāng)加入終體積分?jǐn)?shù)為10%DMSO、1 mmol/L芹菜素、20 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L的UDP、20 mU/mL的SuSy和60 mU/mL的GTBM后，在反應(yīng)4 h后達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率(95%)。Dai等[22]報(bào)道的糖基轉(zhuǎn)移酶Bs-YjiC以0.5 mmol/L的芹菜素為底物，可產(chǎn)生3種糖基化產(chǎn)物，產(chǎn)物類型較多，糖基化總產(chǎn)率約90%。Choi等[26]從鏈霉菌得到的糖基轉(zhuǎn)移酶OleD對50 μmol/L芹菜素進(jìn)行糖基化，生成芹菜素-5，7，3′-O-葡萄糖苷，產(chǎn)率只有35%。本研究構(gòu)建的雙酶耦聯(lián)非水相催化體系糖基化芹菜素，轉(zhuǎn)化率約95%，且糖基化產(chǎn)物較為單一，具有較好的區(qū)域選擇性。

圖6 芹菜素糖基化反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線Fig.6 Time process curve of glycosylation apigenin

2.4 芹菜素衍生物L(fēng)C-MS分析

對芹菜素衍生產(chǎn)物進(jìn)行LC-MS分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品對照初步鑒定了產(chǎn)物，結(jié)果見圖7。由圖7可知，反應(yīng)生成的產(chǎn)物為芹菜素-7-O-葡萄糖苷。

圖7 芹菜素衍生物MS圖譜Fig.7 MS spectrum of apigenin derivatives

3 結(jié)論

通過比較菌庫中糖基轉(zhuǎn)移酶和Bs-YjiC的關(guān)鍵PSPG motif序列，篩選出巨大芽孢桿菌來源的糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM。通過將其插入pET-28a(+)載體并導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)構(gòu)建重組菌株E.coli/pET28a-bmgt并對其在PBS(pH為7.5)、溫度35 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間12 h條件下誘導(dǎo)表達(dá)，得到較多可溶性蛋白和較少的包涵體。His-tag標(biāo)簽法純化得到電泳純的糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM，純酶液比酶活為4.21 U/mg。

研究了pH、溫度、DMSO濃度、蔗糖添加量、UDP添加量和GTBM酶液添加量對糖基轉(zhuǎn)移酶GTBM和蔗糖合成酶SuSy雙酶耦聯(lián)體系糖基化芹菜素轉(zhuǎn)化率的影響。在PBS(pH 7.5)、溫度35 ℃、10%(體積分?jǐn)?shù))DMSO、20 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L UDP、20 mU/mL SuSy、60 mU/mL GTBM時(shí)，其糖基化芹菜素在4 h時(shí)轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%。