液基薄層細(xì)胞p16免疫組化檢測(cè)對(duì)宮頸非典型鱗狀上皮的分流價(jià)值

趙芳，馬德勇，王婷婷，張巖，董穎，趙健

宮頸癌是嚴(yán)重危害婦女健康的第二大惡性腫瘤，病死率僅次于乳腺癌，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。若要達(dá)到2030年全世界范圍內(nèi)消除宮頸癌的目標(biāo)，宮頸癌篩查仍然是目前我國(guó)宮頸癌診治工作的基礎(chǔ)。非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells，ASC)在巴氏(TBS)診斷系統(tǒng)判讀結(jié)果中比例占第二，常規(guī)的分流方法對(duì)高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測(cè)存在特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值偏低的局限性。因此臨床亟待尋找新的技術(shù)手段或新的生物學(xué)標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)ASC風(fēng)險(xiǎn)分層管理。p16抑癌基因蛋白表達(dá)作為早期宮頸癌的生物學(xué)標(biāo)志物，因其具有較高的敏感度和特異度而備受關(guān)注[2]。但研究多集中在對(duì)活檢組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行p16檢測(cè)，盡管標(biāo)本常規(guī)病理診斷是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但需完成篩查轉(zhuǎn)診陰道鏡下有創(chuàng)操作才能取到標(biāo)本，不能作為宮頸癌篩查手段。本研究對(duì)ASC宮頸癌篩查液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查剩余標(biāo)本進(jìn)行p16免疫組化染色檢測(cè)，并與陰道鏡活檢組織病理p16免疫組化結(jié)果對(duì)比，探討液基薄層細(xì)胞學(xué)p16對(duì)ASC人群分流的應(yīng)用價(jià)值，以有效分流管理ASC，提高子宮頸癌前病變檢出率，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年10月于北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的ASC患者109例，均經(jīng)宮頸細(xì)胞學(xué)檢查確診，年齡21～68(38.57±9.74)歲。排除早孕、哺乳期、HPV治療史、宮頸病變或?qū)m頸癌手術(shù)史、放化療史患者。所有患者進(jìn)行標(biāo)本刷宮頸脫落細(xì)胞采樣、液基薄層細(xì)胞學(xué)p16檢測(cè)和HR-HPV檢測(cè)。全部患者72 h內(nèi)無(wú)性生活、陰道上藥、陰道檢查和手術(shù)操作史。脫落細(xì)胞學(xué)采用2014年新修訂的TBS報(bào)告方式進(jìn)行判讀獲得ASC有效分析[3]。ASC又分為不明確意義的不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)74例，不能除外上皮內(nèi)高度病變(ASC-H)35例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 HR-HPV檢查 采用HC-Ⅱ檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)DIGENE公司生產(chǎn))對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HR-HPV DNA檢測(cè)，高危型別包括18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型，嚴(yán)格按試劑盒要求步驟依次完成。以檢測(cè)結(jié)果HR-HPV≥1.0 pg/ml判讀為HR-HPV陽(yáng)性。

1.3 液基薄層細(xì)胞p16檢測(cè) 收集109例ASC患者液基薄層細(xì)胞檢測(cè)剩余標(biāo)本，采用廣州江元醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)提供的全自動(dòng)免疫細(xì)胞獨(dú)立溫控單獨(dú)滴染染色機(jī)(JY-6000)和配套的p16抗體檢測(cè)試劑盒(免疫細(xì)胞化學(xué)法),嚴(yán)格按試劑盒要求步驟依次完成。普通光學(xué)顯微鏡下，以上皮細(xì)胞胞漿(或伴胞核)染為黃色為陽(yáng)性,上皮細(xì)胞胞漿及胞核未見黃色為陰性，見圖1。所有標(biāo)本均由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師閱片診斷。

p16陽(yáng)性 p16陰性

1.4 陰道鏡取材與組織學(xué)檢查 液基薄層細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-US且HR-HPV陽(yáng)性，或液基薄層細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASC-H及以上的患者轉(zhuǎn)診陰道鏡，由陰道鏡專職醫(yī)師依據(jù)陰道鏡操作規(guī)范進(jìn)行檢查。陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸可疑病變部位取活檢，未發(fā)現(xiàn)病變需在血液循環(huán)豐富的區(qū)域取活檢包括頸管內(nèi)膜診刮(ECC)，并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。病理組織學(xué)閱片由2位專門的病理專家完成。分為慢性宮頸炎、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL，包括HPV相關(guān)改變和CIN Ⅰ級(jí))、高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL，包括CINⅡ和CINⅢ級(jí)和宮頸癌)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或率(%)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析法，繪制ROC曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC)檢驗(yàn)2種方法對(duì)高級(jí)別病變的檢驗(yàn)效能，分析兩者臨床診斷價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ASC-US和ASC-H中p16在組織病理結(jié)果中分布情況 在液基薄層細(xì)胞學(xué)判讀為ASC-US的74例標(biāo)本中，p16染色陽(yáng)性37例(50.00%)。組織病理診斷結(jié)果為炎性反應(yīng)或正常組中p16染色陽(yáng)性率為38.18%，LSIL組為57.14%，而HSIL組陽(yáng)性率100%。ASC-US患者中，組織病理結(jié)果HSIL組p16染色陽(yáng)性率>LSIL組>炎性反應(yīng)或正常組，p16陰性和陽(yáng)性的病理結(jié)果分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.216，P=0.001)，見表1。

在液基薄層細(xì)胞學(xué)判讀為ASC-H的35例標(biāo)本中，p16染色陽(yáng)性結(jié)果33例(94.29%)。組織病理診斷結(jié)果為炎性反應(yīng)或正常組p16染色陽(yáng)性率為85.71%，LSIL組為75.00%，HSIL組為100%。ASC-H患者中，組織病理結(jié)果p16染色陽(yáng)性率HSIL組>炎性反應(yīng)或正常組>LSIL組，p16陰性和陽(yáng)性的病理結(jié)果分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.171，P>0.05)，見表1。

表1 組織病理學(xué)結(jié)果不同類型患者的p16陽(yáng)性分布 [例(%)]

2.2 ASC-US和ASC-H中HPV在組織病理結(jié)果中分布情況 在液基薄層細(xì)胞學(xué)判讀為ASC-US的74例標(biāo)本中，HPV陽(yáng)性44例(59.46%)；組織病理診斷結(jié)果為炎性反應(yīng)或正常組HPV陽(yáng)性率50.91%，LSIL組為57.14%，HSIL組為100%。ASC-US患者中，HPV陽(yáng)性和陰性的病理結(jié)果分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.866，P=0.007)。ASC-H患者中，HPV陽(yáng)性和陰性的病理結(jié)果分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.367，P=0.068)，見表2。

表2 組織病理結(jié)果不同類型患者的HPV陽(yáng)性分布比較 [例(%)]

2.3 p16、HPV在 ASC-US中的診斷價(jià)值 在液基薄層細(xì)胞學(xué)判讀為ASC-US的74例標(biāo)本中，p16、HPV的敏感度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%，p16的特異度為59.68%，稍高于HPV的48.39%，p16的陰性預(yù)測(cè)值為59.68%，稍高于HPV的48.39%。p16的AUC為0.884，高于HPV的0.798，見圖2，說明p16檢驗(yàn)準(zhǔn)確性高于HPV，見表3。

圖2 p16、HPV識(shí)別高級(jí)別以上病變的ROC曲線

3 討 論

3.1 液基薄層細(xì)胞學(xué)p16檢測(cè) 大量的流行病學(xué)調(diào)查和研究證實(shí)，持續(xù)性HR-HPV感染是宮頸癌和癌前病變的必要因素[4]，腫瘤抑制基因p16與HPV等多因素導(dǎo)致的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[5]。p16 基因?yàn)槎嗄[瘤抑制基因，其表達(dá)的蛋白可直接參與調(diào)控細(xì)胞周期，通過抑制細(xì)胞增殖和分裂達(dá)到抑癌作用。正常細(xì)胞周期中表達(dá)的p16表現(xiàn)為抗增殖效應(yīng)，因此在終末分化的上皮細(xì)胞中，正常水平下不能用免疫組化方法檢測(cè)到。但在HPV相關(guān)的癌前病變和癌變中，代表確立和維持惡性表型的必要因素E7癌蛋白整合到宿主基因組內(nèi)，結(jié)合Rb蛋白使其失活，細(xì)胞持續(xù)增殖聚集形成腫瘤，相應(yīng)p16出現(xiàn)了強(qiáng)烈的過度表達(dá)而被測(cè)得。因此p16被認(rèn)為是HPV感染轉(zhuǎn)化的一個(gè)替代性標(biāo)志物，用于在宮頸癌篩查中分流管理HR-HPV陽(yáng)性的女性[6-7]。

p16檢測(cè)CINⅡ級(jí)和更嚴(yán)重病變的敏感度與HPV檢測(cè)相似，但特異度更高，可以顯著增加高級(jí)別病變的診斷準(zhǔn)確率，并作為組織病理學(xué)醫(yī)生識(shí)別難以鑒別的LSIL和HISL的依據(jù)。p16陽(yáng)性表達(dá)表示病毒存在，伴隨著宮頸組織由正常發(fā)展到低級(jí)別病變、高級(jí)別病變、直至浸潤(rùn)癌的全過程，其陽(yáng)性率逐漸增強(qiáng)，與CIN疾病具有顯著的一致性[8]，并且p16蛋白的高表達(dá)代表了病毒活動(dòng)整合能力，檢測(cè)p16可以反映細(xì)胞惡變?cè)鲋衬芰?，預(yù)示惡性腫瘤的侵襲性，初步推測(cè)宮頸癌的惡性程度[9]。

表3 p16、HPV在ASC-US中的診斷價(jià)值

3.2 液基薄層細(xì)胞p16、HR-HPV在ASC-US的應(yīng)用價(jià)值 宮頸癌和癌前病變從組織類型分為鱗癌和腺癌，鱗癌來(lái)源于鱗狀上皮，占宮頸癌的80%～85%，識(shí)別鱗狀上皮病變有助于做到大部分宮頸癌的早期識(shí)別。ASC-US在子宮頸細(xì)胞學(xué)篩查結(jié)果中占5.2%～28%[10]，僅次于未見上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM),在細(xì)胞學(xué)異常中占59.3%[11]。由于TCT的TBS系統(tǒng)分類法將標(biāo)本質(zhì)量作為報(bào)告的一部分，ASC-US的判讀多數(shù)是由于炎性反應(yīng)刺激、制片技術(shù)差異、細(xì)胞數(shù)量少或細(xì)胞異常程度不足以診斷上皮病變等，干擾臨床病理學(xué)醫(yī)生而導(dǎo)致的排除性診斷。因此ASC-US的最終組織病理報(bào)告跨度很大，由正常的宮頸到早期浸潤(rùn)癌都有可能，其中僅有約9.7%ASC-US患者組織學(xué)病理確診為高級(jí)別病變[12]。本研究中ASC-US 74例，病理組織證實(shí)HSIL者12例，占比16.22%。ASC-US處理不當(dāng)，可以導(dǎo)致漏診或診療過度，為后續(xù)的不規(guī)范宮頸病變治療帶來(lái)隱患，因此更需要引起臨床高度關(guān)注[13-14]。

宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為初篩手段，在宮頸癌早期篩查中發(fā)揮了十分重要的作用。但一致性差，漏診和誤診率高，尤其漏診容易發(fā)生在細(xì)胞學(xué)診斷為HSIL以下的標(biāo)本和腺癌。而HR-HPV陽(yáng)性僅證明處于感染狀態(tài)，對(duì)于大部分年輕女性可以在感染后的6～9個(gè)月通過表層宮頸細(xì)胞的自然脫落而清除掉HPV，成為暫時(shí)性的一過性感染。但目前HR-HPV檢測(cè)手段不能區(qū)分屬于一過性感染還是持續(xù)性感染，即使持續(xù)性感染也不一定就是宮頸癌前病變或?qū)m頸癌，也不能明確宮頸癌的發(fā)展階段[12]。因此盡管HPV檢測(cè)具有較高的敏感度和陰性預(yù)測(cè)值，但特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低[15]，而導(dǎo)致過度的治療和干預(yù)造成醫(yī)療資源浪費(fèi)。

本研究中細(xì)胞學(xué)ASC-US的74例患者中，炎性反應(yīng)性疾病或正常高危型HPV陽(yáng)性率可達(dá)50.91%(28/55)，因此單純依靠HPV分流，會(huì)增加更多的陰道鏡轉(zhuǎn)診次數(shù)。迫切需要引入有效簡(jiǎn)便用于分流的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究顯示，p16在正常宮頸鱗狀細(xì)胞中或炎性反應(yīng)中僅有38.18%(21/55)表達(dá)，但在HSIL中100%表達(dá)。p16在一定程度上可以評(píng)估HR-HPV感染者發(fā)生高級(jí)別病變的可能性，以p16分流，雙陽(yáng)性轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查，必要時(shí)取活檢；單陽(yáng)性可隨訪；雙陰性可常規(guī)篩查，且適當(dāng)延長(zhǎng)隨訪時(shí)間[16-17]。

3.3 液基薄層細(xì)胞p16、HR-HPV在ASC-H中的應(yīng)用價(jià)值 細(xì)胞學(xué)ASC-H為細(xì)胞學(xué)形態(tài)的異常改變，具有HSIL某些細(xì)胞學(xué)的一些特征，但缺乏明確診斷HSIL的證據(jù)，被認(rèn)為是特殊的可疑或不確定的HSIL。ASC-H的診斷特異度和一致性差，具有較高的誤診和漏診率，且發(fā)生CINⅡ級(jí)以上的風(fēng)險(xiǎn)高。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)ASC-H的35例標(biāo)本中，24例組織學(xué)證實(shí)為CINⅡ級(jí)以上，占比68.57%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道接近[10]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)為ASC-H，漏診為CINⅡ級(jí)以上的幾率高達(dá)63.4%，這一診斷本身也是對(duì)CINⅡ級(jí)以上漏診的獨(dú)立高危因素[18]，因此對(duì)細(xì)胞學(xué)ASC-H的病例需更加關(guān)注，應(yīng)直接轉(zhuǎn)診陰道鏡，根據(jù)陰道鏡檢查結(jié)果選擇不同的隨訪方式。ASC-H的HR-HPV感染陽(yáng)性率更高，因此采用HR-HPV分流沒有更好的證據(jù)支持。本研究發(fā)現(xiàn)，在ASC-H患者中p16在正常宮頸鱗狀細(xì)胞中或炎性反應(yīng)中有85.71%(6/7)表達(dá)，在HSIL中仍是100%表達(dá)，考慮是因?yàn)锳SC-H中炎性反應(yīng)和正常的人數(shù)較少僅7例，導(dǎo)致差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HSIL中p16表達(dá)比率100%，可見p16作為ASC-H的分流同樣有較高的特異度?？梢宰鳛锳SC-H的輔助檢查手段，能減少漏診高級(jí)別子宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)并指導(dǎo)后續(xù)的隨訪監(jiān)測(cè)。

3.4 液基薄層細(xì)胞學(xué)p16彌補(bǔ)TCT的不足 TCT和p16由同一病理醫(yī)師閱片，對(duì)于p16陽(yáng)性，即使細(xì)胞學(xué)未見異常，病理醫(yī)師會(huì)有較高的警覺性進(jìn)行重復(fù)仔細(xì)閱片以免漏診，尤其對(duì)于HSIL和腺上皮病變。此外陰道鏡檢查時(shí)，對(duì)細(xì)胞學(xué)HSIL、ASC-H、AGC且p16陽(yáng)性者，應(yīng)增加血管豐富的部位活檢率和頸管診刮率。由于p16結(jié)果判讀基于顏色的區(qū)別，相比TCT對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的判讀更為簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)數(shù)字化自動(dòng)閱片，節(jié)省細(xì)胞學(xué)篩查的時(shí)間，增加結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。因此敏感度高的p16檢測(cè)可一定程度彌補(bǔ)TCT的不足。

總之，液基薄層細(xì)胞學(xué)p16對(duì)CINⅡ級(jí)以上病變具有良好的敏感度和特異度，敏感度與HR-HPV相似且特異度更好，其表達(dá)與宮頸病變級(jí)別顯著一致，有望成為ASC-US和ASC-H的有效分流方法，避免不必要過度的陰道鏡轉(zhuǎn)診活檢而破壞宮頸完整性。待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探討液基薄層細(xì)胞p16在宮頸病變?cè)\斷和疾病治療檢測(cè)的價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙芳、馬德勇：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；王婷婷:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；張巖、董穎、趙健:提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核