豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測方法的研究

薛 銀，張紅麗，吳贇竑，黃 靖，馮肖肖，劉 霞，吳雪軍，何 杰，張 璐，周彩琴，桂平雄,趙靈燕

(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310020)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對于病原微生物的分析檢測手段越來越先進(jìn)。常規(guī)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析通常采用瓊脂糖電泳分析，操作繁瑣、分析時間長且實驗結(jié)果不易重復(fù)[1]。QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)是一種包括多個激光二極管和微光采集器，片段在凝膠中移動的過程中毛細(xì)管旁路激發(fā)并檢測信號，信號通過光電倍增管傳至可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的專用軟件,進(jìn)行結(jié)果分析的方法。

目前，檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒等動物疫病中，RT-PCR檢測是其中一個重要的方法，在多個檢測標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范中均有應(yīng)用。本研究利用40份經(jīng) RT-PCR檢測為病毒核酸陽性或疑似陽性的豬繁殖與呼吸綜合征核酸樣品，進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物分別用兩種方法進(jìn)行電泳，分析兩種電泳方法的優(yōu)勢，為實驗室豬繁殖與呼吸綜合征等病原微生物分子水平的診斷提供一種更快速、安全的方法。

1 材料和方法

1.1主要實驗材料 40份經(jīng)RT-PCR 檢測為核酸陽性或疑似陽性的豬繁殖與呼吸綜合征核酸樣品。

1.2主要試劑與儀器 豬繁殖與呼吸綜合征病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒購自哈爾濱元亨公司，批號：PRRS20190409P；PCR擴(kuò)增儀，德國Eppendorf 公司生產(chǎn)；電泳儀，型號EPS-301 美國GE公司；凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司生產(chǎn)；QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳預(yù)制膠、Alignment Marker(15 bp-3 kb)和DNA Size Marker(100 bp-2.5 kb)購自杭州怡丹生物技術(shù)公司；QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)購自凱杰企業(yè)管理有限公司。

1.3方法

1.3.1RT-PCR擴(kuò)增 40份病毒核酸樣品，按照試劑盒說明書操作,反應(yīng)程序42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min；循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35次；再72 ℃延伸7 min。

1.3.2電泳:RT-PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行普通瓊脂糖凝膠電泳和QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳 稱取3 g瓊脂糖放于500 ml錐形瓶中，加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液200 ml，微波爐中溶解，再加入10 μL染色液混勻，待凝膠凝固后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL點樣于瓊脂糖凝膠孔中，120 V電壓，電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)分析記錄PCR條帶。

QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳：按照操作要求，進(jìn)行卡夾校準(zhǔn)，并在Cartridge stand溶液槽中加入相對應(yīng)的試劑，注意加入的液體中不要有氣泡，然后在Buffer Tray 試劑槽加入Alignment Marker等，直接上機(jī)，利用QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1普通瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 40份核酸樣品的RT-PCR產(chǎn)物，凝膠電泳顯示有27份陽性樣品，陽性率為67.5%(27/40)，電泳結(jié)果見圖 1。

2.2QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果 QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳顯示31份陽性樣品，陽性率77.5%(31/40)，電泳結(jié)果見圖2。

圖1 常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果(A11、C11為陰性對照，B11、D11為陽性對照；A12、B12、C12、D12為Size Marker)

3 討論

通常普通RT-PCR產(chǎn)物需要通過凝膠電泳進(jìn)行產(chǎn)物分析，而普通凝膠電泳費時、污染高、分辨率低，極大限制了PCR 技術(shù)的發(fā)展[2]。相比于普通的瓊脂糖凝膠電泳，QIAxcel Advanced毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)全自動上樣和自控組件將接觸如EB等危險化學(xué)品的風(fēng)險率降至最低。只需簡單的幾步操作：預(yù)制膠卡夾、預(yù)裝的緩沖液槽及裝載有樣本的96孔板或PCR管或聯(lián)管、儀器連接軟件然后進(jìn)行電泳分析結(jié)果。無需冗長的制膠過程，簡化了日常工作的整個流程，一次可以分析95個樣品(1個樣品孔為Size Marker)，極大地減輕了工作量。

毛細(xì)管電泳分析分辯率可達(dá)5～15 bp，能夠分辯出瓊脂糖電泳所不能分離的條帶[1],本實驗QIAxcel毛細(xì)管電泳與普通凝膠電泳相比，陽性檢出率更高，表明毛細(xì)管電泳有更好的敏感度。鄔旭龍等將多重PCR與QIAxcel毛細(xì)管電泳系統(tǒng)聯(lián)用，同時檢測7種豬主要疫病，很好地解決因目的條帶大小過于接近所導(dǎo)致的普通凝膠電泳難以分開的難題，且檢測時長也大大縮短[3]。實驗過程中，為了方便篩選目的條帶，可以在每一行樣品中加入一份陽性對照樣品，這樣結(jié)果就會一目了然。由于毛細(xì)管電泳是根據(jù)電泳遷移的時間和標(biāo)準(zhǔn)品計算出來的結(jié)果，會有點偏差，所以加入陽性對照樣品可以盡量減少結(jié)果偏差。

綜上，將RT-PCR與QIAxcel毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)合起來檢測病原微生物，為實驗室檢測病原微生物提供了一種更高效、安全的方法，并有更高的靈敏度。