代謝組學(xué)技術(shù)在心臟驟停中的應(yīng)用進展

周靚，唐軼珣，祝益民

湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院，長沙410002

心臟驟停(CA)是全球?qū)е滤劳龅闹饕蛑?，美國每年約35萬人[1]、歐洲每年35萬～70萬人[2]死于心臟驟停。根據(jù)Zhang等[3]的報告,國內(nèi)每年因CA而死亡的人數(shù)估計達54.4萬人。盡管目前心肺復(fù)蘇術(shù)(CPR)的實施有所增加、復(fù)蘇后治療有所改善，但CA的病死率仍較高，院外心臟驟停(OHCA)、院內(nèi)心臟驟停(IHCA)患者的總存活率分別為9.6%、17%[4]。CA患者經(jīng)CPR后恢復(fù)自主循環(huán)(ROSC)，但存活者可能會出現(xiàn)以腦損傷、心肌功能障礙、全身缺血再灌注損傷為主要表現(xiàn)的心臟驟停后綜合征(PCAS)[5]。因此，CA后器官損傷機制、相關(guān)病理生理過程及病因復(fù)雜，機制尚未完全闡明。代謝組學(xué)是繼基因、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后發(fā)展起來的一種新興的研究系統(tǒng)生物學(xué)的方式。代謝組學(xué)被認為是一種行之有效的系統(tǒng)方法來表征代謝表型，這是對于包括環(huán)境、藥物、飲食方式、生活習(xí)慣、遺傳、微生物等各種內(nèi)在和外在參數(shù)的一個協(xié)調(diào)的生理反應(yīng)的結(jié)果。CA的發(fā)生必然伴隨著代謝的改變，代謝組學(xué)是從小分子代謝物及其轉(zhuǎn)化途徑進行分析，使人們更深層次理解CA發(fā)生機制及過程，為靶向器官功能的復(fù)蘇與保護研究提供新的研究思路及方法。有研究表明，結(jié)合代謝組學(xué)分析有助于全面了解CA發(fā)病機制、早期診斷、疾病病情評估、預(yù)后及療效評估等[6]。現(xiàn)對代謝組學(xué)在CA中的應(yīng)用進展進行簡要綜述。

1 代謝組學(xué)概念及研究過程

早在1999年，由英國Nicholson教授領(lǐng)導(dǎo)的科研團隊正式提出代謝組學(xué)的概念：代謝組學(xué)是研究生物體在基因修飾下或受病理生理刺激后所有動態(tài)代謝產(chǎn)物的一門學(xué)科[7]，研究對象主要是細胞、組織或生物體液中內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物(<1 000 Da)。代謝組學(xué)研究過程通常為生物樣本采集、預(yù)處理、分離、檢測及鑒定，然后進行數(shù)據(jù)分析，進一步篩選生物標志物和分析代謝途徑。

代謝組學(xué)研究常用的檢測標本包括血液、尿液、膽汁、腦脊液、唾液、組織、細胞培養(yǎng)液和提取物等[8]，這些生物樣品中代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化，能反映機體疾病狀態(tài)或健康狀態(tài)下的重要信息，在疾病診斷、微生物、植物及功能基因組等研究領(lǐng)域中發(fā)揮日益重要的作用[9]。代謝組學(xué)中最常見的分析技術(shù)主要包括核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)、色譜、毛細管電泳、紫外線吸收、紅外光譜、放射性檢測、庫倫分析等[10]。由于代謝組學(xué)所分析的樣品種類、濃度、性質(zhì)具有差異，沒有一種分析手段能檢測出所有種類的化合物，故應(yīng)根據(jù)研究目的及樣本的性質(zhì)來綜合應(yīng)用多種技術(shù)平臺。通過代謝組學(xué)分析技術(shù)產(chǎn)生的大量原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過一系列的預(yù)處理后，可通過多元統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)加以整合后從中獲取所需的生物學(xué)信息，包括生物表型及標志物等信息。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在CA中的應(yīng)用

2.1 代謝組學(xué)技術(shù)在明確CA病因中的應(yīng)用 引起CA的病因眾多，包括心臟、呼吸、循環(huán)、代謝、中毒、環(huán)境等。有研究表明，CA病因不同，其病理生理機制、組織損傷、復(fù)蘇后器官功能障礙和對治療的反應(yīng)有顯著差異。CA發(fā)生的原因常由臨床醫(yī)生根據(jù)患者既往史、發(fā)病情況、臨床表現(xiàn)、輔助檢查等作出判斷。然而，在無第一目擊者情況下，患者突發(fā)CA，特別是在進行CPR時，明確其病因常十分困難。因此早期識別其病因以指導(dǎo)有效的后續(xù)治療尤為重要。

Varvarousis等[11]通過高分辨核磁共振氫譜(1H-NMR)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)在研究窒息致心臟驟停(ACA)和心室顫動致心臟驟停(VFCA)兩種不同病因的CA豬模型中發(fā)現(xiàn)，兩者代謝指紋在驟停和復(fù)蘇階段顯著不同：ACA組在窒息期和驟停期表現(xiàn)出明顯的代謝紊亂，而VFCA組這種現(xiàn)象在復(fù)蘇階段發(fā)生變化。三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)發(fā)生了代謝紊亂，CA預(yù)后不良的生物標志物為琥珀酸的高表達。因此，琥珀酸可為OHCA患者或法醫(yī)提供重要的臨床信息，并有助于確定CA的病因。Locci等[12]應(yīng)用高分辨1H-NMR代謝組學(xué)技術(shù)，研究CA各階段的不同代謝特征，發(fā)現(xiàn)在CA期間，三磷酸腺苷(ATP)的消耗導(dǎo)致肌苷增加，無氧糖酵解加速使琥珀酸增加，琥珀酸和肌苷為窒息性CA的生物標志物。由于國內(nèi)外關(guān)于CA病因的代謝組學(xué)研究較少，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，將有更多學(xué)者致力于使用代謝組學(xué)方式從病因方面深入研究CA。

2.2 代謝組學(xué)技術(shù)在CA器官損傷與保護中的應(yīng)用

2.2.1 CA腦損傷與保護的代謝組學(xué)研究 CA后造成的腦損傷是其高致殘率、高病死率的主要原因。大腦獨特的脆弱性是由于它對缺血的耐受性有限，以及對再灌注的獨特反應(yīng)。CA后引起的腦損傷機制復(fù)雜，包括興奮性毒性、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂、自由基形成、病理性蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)和細胞死亡信號通路激活等[13]。腦缺血、缺氧病理狀態(tài)下可導(dǎo)致器官、組織及細胞的能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝及脂類代謝發(fā)生紊亂，通過代謝組學(xué)分析健康狀態(tài)與CA后的差異代謝物，可對CA致腦損傷進行預(yù)后評估。

大腦是葡萄糖代謝最旺盛的組織，其儲備的能量代謝底物較少。因此，大腦對缺血缺氧非常敏感。Baranovicova等[14]通過NMR代謝組學(xué)技術(shù)分析大腦血液停止后的代謝組學(xué)變化，結(jié)果顯示，由于缺血性損傷，糖酵解途徑受到干擾，導(dǎo)致酮體(丙酮、乙酰乙酸和β-羥基丁酸)水平增加、糖酵解產(chǎn)物含量下降。這與腦氧供停止后無氧代謝增加相關(guān)。有研究顯示，CA后腦組織內(nèi)糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物減少(如1,6-二磷酸酯果糖、3-磷酸甘油酸和檸檬酸)[15]。另有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖代謝相關(guān)物質(zhì)與窒息后的氧化應(yīng)激相關(guān)[16]，該研究對窒息新生兒尿液的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，尿中有機酸升高與神經(jīng)發(fā)育結(jié)局顯著相關(guān)，并且與氧化應(yīng)激有關(guān)，有高度敏感性和特異性。其中丙二酸乙酯、3-羥基-3-戊二酸甲酯與良好的神經(jīng)發(fā)育有關(guān)，而戊二酸、丙二酸甲酯、3-羥基丁酸等則與預(yù)后不良有關(guān)。在新生窒息的仔豬模型中，使用1H-NMR進行尿液的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，代謝變異與缺氧水平相關(guān)，主要是由于尿素、肌酐、丙二酸、甲基胍、羥基異丁酸的差異顯著[17]。Kim等[18]在心臟驟停-體外循環(huán)(CPB)復(fù)蘇大鼠模型中，通過GC-MS和LC-MS/MS檢測大鼠心臟和腦組織中的非靶向代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在CA期間，心臟和腦組織中脂類和碳水化合物代謝產(chǎn)物水平有顯著變化，而在進行CPB復(fù)蘇后，僅在腦組織中發(fā)現(xiàn)糖酵解受損和溶血磷脂增加，這表明能量代謝改變和磷脂降解可能是無法成功復(fù)蘇大腦的原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸和丙酮酸可作為神經(jīng)功能和預(yù)后的預(yù)測指標[19]。針對CA后腦組織損傷的治療中，被公認為有效的治療方式是亞低溫[20]，目前尚無藥物干預(yù)措施為CA患者提供神經(jīng)保護。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，二氯乙酸治療可增強CA大鼠模型丙酮酸脫氫酶活性，促進丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，增加ATP的生成、降低乳酸和丙酮酸水平，同時會降低腦海馬和皮質(zhì)中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)的表達，可改善大鼠存活率及神經(jīng)功能障礙。這一研究可為新的藥物改善CA患者腦神經(jīng)功能缺損提供新視角。

從食物中吸收的氨基酸，在糖代謝中分解，一類用于合成輔酶A和參與三羧酸循環(huán)，然后迅速轉(zhuǎn)運至大腦中儲存；另外一類氨基酸則作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)，參與大腦神經(jīng)信息的傳遞。在Hua等[22]研究中發(fā)現(xiàn)，CA后誘導(dǎo)低溫減輕并延遲腦脊液中谷氨酸增加，有助于神經(jīng)功能的保護。已有研究表明，通過抑制Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ的活性，減少谷氨酸信號的傳導(dǎo)，可保護幸存的神經(jīng)元免受功能性重塑，并降低行為學(xué)習(xí)缺陷[23]。Hsu等[24]研究顯示，由組氨酸-色氨酸-酮戊二酸組成的氨基酸緩沖液通過維持升高缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)水平、抑制procaspase-3活化和降低煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶-4(NOX4)表達，保護CA后大鼠的神經(jīng)功能。

脂質(zhì)作為膜、生物能原料和信號分子的基本組成部分參與機體的生命活動。而大腦是人體脂質(zhì)含量最高的器官。通過對脂質(zhì)的分析可發(fā)現(xiàn)人類健康和疾病的生物標志物。研究顯示，與氨基酸庫不同，大腦中的脂肪酸池保持相對正常，在CA 20 min后，亞油酸顯著降低[15]。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)，CA后進行CPB復(fù)蘇的大鼠腦損傷與磷脂或其氧化修飾的減少無關(guān)，而溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿僅在大腦中顯著增加，表明磷脂代謝受損可能與缺血性腦損傷的嚴重程度相關(guān)。Anthonymuthu等[26]對CA患者行血漿腦特異性心磷脂靶向脂質(zhì)組學(xué)研究，篩選出心磷脂(70∶5)可作為預(yù)測腦損傷嚴重程度和預(yù)后的標志物。

2.2.2 CA心臟損傷與保護的代謝組學(xué)研究 CA發(fā)生后，機體處于嚴重的全身缺血缺氧狀態(tài)，經(jīng)實施CPR后，患者恢復(fù)了自主循環(huán)后出現(xiàn)再灌注損傷。與急性心肌梗死所致的局部心肌頓抑不同，CA后心肌功能障礙是全身循環(huán)完全停止后所致的全身性心肌頓抑的一種特殊類型[27]。有研究表明，ROSC后的心肌損傷是患者早期死亡的重要原因[28]。代謝組學(xué)技術(shù)以獨特的優(yōu)勢能反映CA-CPR后所引起體內(nèi)代謝物的動態(tài)變化，更深入探討CA后心肌損傷病理機制，以期提高對CA患者的救治成功率。

Shibayama等[29]在離體犬CA模型中，通過GC-MS技術(shù)研究了長時間室顫致CA后早期電衰竭的代謝物改變，研究顯示糖酵解代謝增強導(dǎo)致乳酸堆積，這是電抑制和心臟停搏的關(guān)鍵代謝決定因素，室顫發(fā)生后出現(xiàn)的能量失衡程度決定糖酵解的速率。另外，無機焦磷酸鹽可防止缺血早期線粒體膜電位丟失和電衰竭，兩種保護作用之間的聯(lián)系可能與線粒體ATP水解速率降低和乳酸堆積相關(guān)。這項研究闡明了長時間室顫惡化致CA的病理生理學(xué)機制。

Tsai等[30]采集恢復(fù)了自主循環(huán)的IHCA患者血清樣本，研究顯示支鏈氨基酸與胰島素抵抗有關(guān)，可能會增加冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和隨后心血管事件發(fā)生的風(fēng)險，丙氨酸與心臟手術(shù)中的缺血再灌注損傷有關(guān)，因此支鏈氨基酸和丙氨酸成為潛在的預(yù)測IHCA患者預(yù)后的生物標志物。

脂肪酸是心肌的主要能量來源之一，在心肌缺血時脂肪酸代謝受到抑制，非酯化脂肪酸顯著升高[31]。Kim等[25]在大鼠CA-CPB復(fù)蘇模型中研究發(fā)現(xiàn)，無論是CA后，還是復(fù)蘇成功后，心臟的總磷脂含量并無明顯變化，而各組成成分發(fā)生改變，如溶血磷脂酰肌醇在CA期間顯著增加，經(jīng)CPB復(fù)蘇后降低，但其他溶血磷脂種類無明顯變化。這種獨特反應(yīng)表明，磷脂酰肌醇代謝對缺血和復(fù)蘇所改變的細胞狀況高度敏感。

2.2.3 CA腎臟損傷與保護的代謝組學(xué)研究 CA時間較長或復(fù)蘇后腎臟持續(xù)的低灌注，易發(fā)生急性腎損傷，甚至迅速發(fā)展為急性腎衰竭，病死率較高。目前，臨床上腎損傷惟一可靠的檢測指標是血肌酐和尿量。但是，血肌酐和尿量并不是最感敏的指標，容易受多種外在因素的影響。通過代謝組學(xué)研究CA后腎臟組織代謝譜的演變規(guī)律，可為腎臟損傷尋找新的診斷、治療方法提供研究線索。

目前，關(guān)于CA后的腎臟代謝改變文獻較少。Kim等[25]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后腎臟氨基酸和脂肪酸代謝物減少，而三羧酸循環(huán)代謝物顯著增加。腎臟中氨基酸代謝呈現(xiàn)出一種失調(diào)模式，惟一不受CA影響的是谷氨酰胺、蘇氨酸、丙氨酸和纈氨酸，其余的氨基酸則顯著減少；復(fù)蘇后顯示有更多的代謝紊亂，除谷氨酸、丙氨酸和纈氨酸外，所有測定的氨基酸均顯著減少。脂質(zhì)代謝總體趨勢：缺血期間，腎臟組織中的脂質(zhì)增加，如棕櫚酸和硬脂酸顯著增加；復(fù)蘇后血流恢復(fù)，脂質(zhì)多恢復(fù)至正常水平或降低，如硬脂酸趨于正常化，而亞油酸和亞麻酸降低。糖酵解和三羧酸循環(huán)代謝物的變化如下：在CA后3-磷酸甘油酸和酮戊二酸顯著升高；然而，CPB復(fù)蘇后檸檬酸、酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸和草酰乙酸等顯著增加。

綜上所述，盡管通過代謝組學(xué)技術(shù)，可找出CA后不同器官的差異性代謝物，但諸多研究者并未深層次地研究這些代謝產(chǎn)物在CA后器官損傷中的致病機制，亦未能探討不同代謝產(chǎn)物間是否有關(guān)聯(lián)。CA后不同器官的差異代謝產(chǎn)物不同，有可能與檢測技術(shù)、不同物種等因素有關(guān)，但更可能與器官的代謝模式相關(guān)，同一代謝物對應(yīng)的器官損傷可能不一樣。因此，通過代謝組學(xué)技術(shù)描繪特定器官的代謝指紋，有助于靶向器官功能的復(fù)蘇與保護?；颊叩膹?fù)蘇成功首先取決于自主循環(huán)恢復(fù)，其次取決于代謝途徑受損的正常化。然而，除了初級代謝改變之外，各種次級代謝改變繁雜，如何在這么多改變的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的標志物，更具有挑戰(zhàn)性。