緊密連接在血腦屏障中的研究進(jìn)展

王明明，唐瑞天，萬(wàn)群，徐麗麗，劉建雄*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州；2.甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州)

0 引言

BBB 是腦部重要的結(jié)構(gòu)之一，對(duì)大腦起到屏障的作用，其組成較為復(fù)雜。各種因素都可對(duì)其調(diào)控，其中緊密連接更為重要。1963 年Farquhar 等首次通過(guò)電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)了緊密連接(tight junctionTJ)。位于相鄰內(nèi)皮細(xì)胞質(zhì)膜間的TJ 可延伸至內(nèi)皮細(xì)胞間隙，為細(xì)胞旁擴(kuò)散創(chuàng)造一種代謝和物理屏障，在維持血腦屏障完整性和通透性方面發(fā)揮著重要作用。其可限制血液和大腦之間的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，以維持腦內(nèi)微循環(huán)的平衡。正常生理?xiàng)l件下，TJ 是一種大型的、具有高度動(dòng)態(tài)性的復(fù)合物，由跨膜蛋白Occludin 和Claudins、細(xì)胞質(zhì)蛋白(zona occluden ZO)、連接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)和細(xì)胞骨架蛋白等組成[1]。TJ 是高度專門化的，具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，可以決定細(xì)胞極性。其組成蛋白復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)外因子的嚴(yán)格調(diào)控下，不斷發(fā)生重構(gòu)和變化改變它的生物特性，從而改變血腦屏障的通透性[2]。

1 緊密連接的組成

1.1 Occludin

Occludin 是第一個(gè)被鑒定的完整TJ 蛋白，具有60 kDa四聚體膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其基因定位到染色體帶5q.13.1，該蛋白是一種完整的膜蛋白，其含有四個(gè)與連接蛋白相當(dāng)?shù)氖杷Y(jié)構(gòu)域，連接蛋白是位于間隙連接處的完整膜蛋白；氨基酸序列為四個(gè)跨膜區(qū)段，兩個(gè)含有44 個(gè)氨基酸的細(xì)胞外環(huán)和兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域[3]。第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)的氨基酸序列高度濃縮，含有豐富的酪氨酸和甘氨酸殘基(約占60%)，第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)對(duì)TJ 有特異性的調(diào)節(jié)功能，是細(xì)胞間形成TJ 的主要部位。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)細(xì)胞外環(huán)在Occludin 定位中起關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)Occludin 結(jié)構(gòu)的研究表明，Occludin 的NH2-末端有4 個(gè)結(jié)構(gòu)域，將蛋白分為5 個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域[4]。COOH-末端結(jié)構(gòu)域由約250 個(gè)氨基酸殘基組成，位于細(xì)胞質(zhì)中。帶電荷的氨基酸在COOH-末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中高度富集，COOH-末端融合蛋白特異性的與ZO-1、ZO-2 和許多其他外周膜蛋白的復(fù)合物相結(jié)合。當(dāng)Occludin C 端截短可導(dǎo)致其與ZO-1 的相互作用喪失，阻止其組裝成TJ[5]。

1.2 Claudins

隨著對(duì)Occludin 功能認(rèn)識(shí)的研究，另外兩個(gè)完整的TJ 蛋白被發(fā)現(xiàn)。Furuse[6]等發(fā)現(xiàn)了Claudin-1 和Claudin-2。進(jìn)一步得出，Claudins 與Occludin 結(jié)構(gòu)相似，Claudins 有4 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2 個(gè)細(xì)胞外環(huán)，但它們與Occludin 的序列無(wú)相似性。Claudins 家族前兩者的發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著TJ 研究的一個(gè)里程碑，其分子量大小約22～27 kDa，該膜蛋白家族有24 個(gè)成員，并揭示了Occludin 不是唯一位于緊密連接處的完整膜蛋白。Claudin-1 和Claudin-2 在細(xì)胞接觸部位高度集中[7]。當(dāng)Occludin 與Claudin-1 共轉(zhuǎn)染時(shí)，明顯表達(dá)的蛋白在細(xì)胞接觸區(qū)域聚合成良好的鏈網(wǎng)。表明Occludin 的修飾可能會(huì)基于Claudins 的表達(dá)特性，或需要Claudins 才能完全插入形成的TJ 中。

大腦內(nèi)皮細(xì)胞也可表達(dá)Claudin-3 和Claudin-5[8]。Claudin-5通過(guò)順式和反式同型二聚或異型二聚支持TJ 完整性，其缺失可導(dǎo)致BBB 破壞。Claudin-5 蛋白沿腦血管表達(dá)，提示Claudin-5與血腦屏障完整性密切相關(guān)，可作為血腦屏障功能狀態(tài)正常和紊亂的敏感指標(biāo)。Claudin-5 的缺乏可直接導(dǎo)致血腦屏障通透性和選擇性的增加。Claudin-5 也參與TJ 的選擇性滲透和細(xì)胞極化。迄今為止可證明claudin-3 和claudin-5 在BBB TJ 中的定位[9]。

1.3 細(xì)胞質(zhì)蛋白(zonaoccluden ZO)

ZO 屬于膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶家族，有ZO-1、ZO-2、ZO-3三種構(gòu)型，并且三者可組成ZO-1/ZO-2/ZO-3 復(fù)合體，其中ZO-1 是組成BBB 中最重要的一種[10]。ZO-1 是一種胞質(zhì)膜相關(guān)的副蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量約為220 kDa。ZO-1 包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域：PSD95、DlgA、ZO-1 同源域，一個(gè)SRC 同源性3 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)酵母鳥(niǎo)苷酸激酶同源域。ZO-1 是TJ 的主要銜接蛋白，一方面與Occludin 的C 端區(qū)域相互作用，對(duì)于TJ 中Occludin 的組裝和維持至關(guān)重要；另一方面與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用，形成細(xì)胞與細(xì)胞骨架之間的連接點(diǎn)[11]。

1.4 連接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)

1998 年Martin-Padura 等發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)糖基化的跨膜蛋白：連接黏附分子，它屬于免疫球蛋白家族，由胞外的兩個(gè)免疫球蛋白樣區(qū)域、一個(gè)跨膜區(qū)域、胞漿區(qū)的一個(gè)C 端區(qū)域組成，可分為JAM-1、JAM-2、JAM-3 和ESAM 四種[12]。其中JAM-1 與BBB 內(nèi)皮細(xì)胞之間TJ 有密切關(guān)系，JAM-1 分子量大約40kDa，由一個(gè)跨膜區(qū)域，2 個(gè)免疫球蛋白樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成細(xì)胞外區(qū)域[13]。JAM-1 是跨膜蛋白中介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間互相結(jié)合的一類分子，其表達(dá)可直接影響緊密連接功能[14]。有研究表明用微波輻射大鼠血腦屏障，檢測(cè)腦組織JAM-1 的表達(dá)量，結(jié)果顯示其表達(dá)量減少，表明JAM-1 有可能參與微波輻射致BBB 通透性增高的病理過(guò)程[15]。JAM 與ZO-1 共沉淀中，說(shuō)明JAM 可能通過(guò)ZO-1 間接介導(dǎo)Occludin 向TJ募集。

1.5 細(xì)胞骨架蛋白

肌動(dòng)蛋白為細(xì)胞骨架的主要成分，此蛋白是細(xì)胞中一種分子量為中等大小的重要蛋白。由375 個(gè)氨基酸殘基組成，是一個(gè)較大的、極其高度保守的基因編碼。多個(gè)肌動(dòng)蛋白形成多聚體，亦稱肌動(dòng)蛋白絲，稱為纖維狀肌動(dòng)蛋白(fibrosactin F-actin)[16]。有學(xué)者通過(guò)缺氧的環(huán)境刺激內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)骨架蛋白F-actin 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。結(jié)果表明缺氧導(dǎo)致BBB 通透性改變可能與F-actin 結(jié)構(gòu)發(fā)生重排有關(guān)，而與F-actin 的表達(dá)量無(wú)關(guān)[17]。有研究表明通過(guò)氧糖剝奪預(yù)處理大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間TJ，可誘導(dǎo)缺血耐受產(chǎn)生，降低內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，使細(xì)胞間ZO-1 和F-actin 的膜定位發(fā)生改變，最終對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷起保護(hù)作用[18]。

肌動(dòng)蛋白共沉積研究示，Occludin 以及ZO-2、ZO-3 在體外均與F-actin 直接相互作用，表明肌動(dòng)蛋白在TJ 處參與了多種相互作用。然而actin-TJ 復(fù)合物相互作用更全面的表明，Occludin、ZO-2 和ZO-3 不結(jié)合F-actin 末端，可能與F-actin 細(xì)絲側(cè)結(jié)合蛋白連接[19]。在Occludin 的COOH 端細(xì)胞質(zhì)域中也發(fā)現(xiàn)了F-actin 結(jié)合活性，而連接蛋白和F-actin之間的特定相互作用的功能還未被很好地理解。

2 緊密連接的作用

2.1 Occludin 的磷酸化與去磷酸化

Farshori 等通過(guò)誘導(dǎo)TJ 的開(kāi)放和再封閉，研究了融合MDCK 細(xì)胞單層中Occludin 的磷酸化。TJ 通透性和蛋白激酶C-a 易位的增加與Occludin 磷酸化的可逆增加一致[20]。這說(shuō)明蛋白激酶C-a 通過(guò)調(diào)節(jié)Occludin 磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)TJ 屏障效能。Sontag[21]等人研究了蛋白磷酸酶2A (PP2A) 在TJ調(diào)控中的作用，PP2A 是重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。TJ 區(qū)PP2A 的增加導(dǎo)致Occludin 去磷酸化，同時(shí)降低跨上皮電阻，并阻止TJ 的發(fā)生：也提出PP2A 可能直接靶向并調(diào)控aPKC/Par-3 信號(hào)復(fù)合物，而aPKC/Par-3 信號(hào)復(fù)合物在調(diào)節(jié)TJ 組裝和屏障功能方面發(fā)揮作用。該研究中Occludin 去磷酸化表明Occludin 是上皮細(xì)胞中PP2A/aPKC 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶點(diǎn)。酪氨酸磷酸化與上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞TJ 通透性增加也有關(guān)。

Occludin 細(xì)胞內(nèi)C 端尾部酪氨酸磷酸化水平被認(rèn)為是決定其與ZO-1、ZO-2、ZO-3 等TJ 蛋白結(jié)合能力的關(guān)鍵[22]。結(jié)果表明酪氨酸磷酸化的Occludin 結(jié)合ZO-1、ZO-2、ZO-3蛋白的數(shù)量比非磷酸化的Occludin 高數(shù)倍。可認(rèn)為氧化應(yīng)激刺激的酪氨酸磷酸化可能改變TJ 復(fù)合物，結(jié)果示氧化應(yīng)激誘導(dǎo)Occludin 和ZO-1 酪氨酸磷酸化，并通過(guò)酪氨酸激酶依賴機(jī)制將Occludin-ZO-1 復(fù)合物從TJ 和細(xì)胞骨架部分解離[23]。Occludin 和ZO-1 的酪氨酸磷酸化提示酪氨酸磷酸化可能介導(dǎo)TJ 對(duì)Occludin-ZO-1 復(fù)合物的破壞和重新定位，從而導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性增加

2.2 Occludin 與GTPases 的關(guān)系

Occludin 功能磷酸化階段也受小GTPases 的影響。小GTPases 是一類gtp 結(jié)合蛋白，調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，包括調(diào)節(jié)TJ 通透性。該家族中有100 多個(gè)蛋白。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能，將Ras 超家族分為五個(gè)主要的亞家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Rab。Ras 超家族的幾個(gè)成員已被證明可以調(diào)節(jié)Occludin的結(jié)構(gòu)和功能。Jou[24]等研究了Ras 相關(guān)的小gtp 結(jié)合蛋白R(shí)hoA 和Rac1 在TJ 結(jié)構(gòu)和功能組織中的作用。

本構(gòu)型活性RhoA 和Rac1 突變體對(duì)Occludin 的分布產(chǎn)生了較大的破壞，這說(shuō)明RhoA 和Rac1 在調(diào)節(jié)Occludin 功能中發(fā)揮作用。Ras 及其驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)通路可能是TJ 功能的調(diào)節(jié)因子，特別是Raf1 被認(rèn)為是Ras 的主要的中下游效應(yīng)因子。Li 和Mrsny[25]證明Occludin 受致瘤因子Raf1 下調(diào)，與TJ 完整性的缺失有關(guān)。

當(dāng)ATP 耗盡后，Occludin 中磷酸化氨基酸水平加速下降。此外，Occludin 中絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的調(diào)控與Rho GTPase 突變體的表達(dá)一致，這表明Rho 信號(hào)調(diào)控Occludin 活性。從本質(zhì)上講，Rho 信號(hào)活性的提高保護(hù)了TJ 免受ATP 耗盡所帶來(lái)的有害影響[26]。Rho 的關(guān)鍵下游靶點(diǎn)p160 ROCK/Rho 激酶已被證實(shí)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，與調(diào)控肌動(dòng)蛋白組織有關(guān)。結(jié)果示Occludin 的磷酸化受到RhoA-p160 ROCK 依賴和獨(dú)立途徑的調(diào)控。這表明Occludin 磷酸化可能獨(dú)立于細(xì)胞骨架介導(dǎo)TJ 改變，而Occludin 是調(diào)控其磷酸化受體刺激信號(hào)通路的靶點(diǎn)[27]。

Rho 調(diào)控TJ 的另一種模式可能涉及直接修飾連接膜蛋白。當(dāng)本構(gòu)型活性形式的RhoA 在MDCK 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，Occludin 磷酸化水平升高，表明Rho 信號(hào)可以直接影響TJ 蛋白。當(dāng)Rho 受到內(nèi)皮細(xì)胞中LPA 或組胺刺激時(shí)，Occludin 羧基端磷酸化增加，這被認(rèn)為是調(diào)節(jié)Occludin 與連接肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的相互作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性。

2.3 其他蛋白

Zuoet[28]等認(rèn)為糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β)可能影響Claudins 的表達(dá)，Lengfeld[29]等人的研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)增加Claudins 表達(dá)，控制BBB 的發(fā)育，增強(qiáng)BBB 表型，通過(guò)抑制GSK-3β 激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可以增加β-catenin、Claudin-3 和ZO-1 的表達(dá)，從而減弱BBB的破壞。Taddei[30]等人報(bào)道，PI3K/Akt 活化可以限β-catenin向細(xì)胞核的易位，最終增加了Claudin-5 的表達(dá)。研究也表明，PI3K/Akt 的 激 活 可 以 通 過(guò)GSK-3β 和β-catenin 提 高Claudin-3 和Claudin-5 的表達(dá)。

ZO 是沿細(xì)胞膜連續(xù)分布的細(xì)胞間TJ 復(fù)合物的重要結(jié)構(gòu)蛋白，與Occludin 和Claudins 相互作用，將TJ 錨定在內(nèi)皮細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白上[31]。ZO-1 不是特異性的TJ 標(biāo)志物，但是TJ 的重要調(diào)控因子，在維持細(xì)胞極性、細(xì)胞骨架形成、TJ 定位、細(xì)胞旁屏障等方面發(fā)揮重要作用，ZO-1 與BBB滲透率也密切相關(guān)。ZO 蛋白對(duì)于緊密連接處的Claudins 和Occludin 的組裝至關(guān)重要，從而將它們錨定在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上。JAM 具有細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附作用，也參與TJ 滲透性的調(diào)控和調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控及其與TJ 組分的相互作用在上皮屏障特性的調(diào)控中起著重要的錨定作用。提供了連接的穩(wěn)定性，以及在連接重塑和細(xì)胞形狀變化過(guò)程中起到傳遞力的連接器。

3 展望

BBB 具有重要的屏障功能，對(duì)維持中樞系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境起到非常關(guān)鍵的作用，而TJ 的開(kāi)放與關(guān)閉調(diào)控著B(niǎo)BB 的功能。目前人們對(duì)緊密連接的組成，結(jié)構(gòu)以及功能的認(rèn)識(shí)還不夠充足。今后隨著人們對(duì)血腦屏障研究的不斷認(rèn)識(shí)，對(duì)TJ 各種組成以及功能的不斷了解，認(rèn)識(shí)到BBB 的變化以及TJ 組成的異常都會(huì)出現(xiàn)各種疾病。雖然各種成像技術(shù)，分子生物學(xué)技術(shù)相對(duì)比較成熟，但是對(duì)TJ 蛋白之間互相協(xié)調(diào)、互相影響機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不足。在以后通過(guò)多學(xué)科合作，各種先進(jìn)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)新知識(shí)的不斷探索，會(huì)對(duì)BBB-TJ 更有深刻的認(rèn)識(shí)，提前做到對(duì)疾病的預(yù)防，以及新藥物更能容易透過(guò)BBB，對(duì)治療疾病找到最新的、可靠的作用靶點(diǎn)。