飼糧中霉菌毒素快速檢測技術研究現狀及發(fā)展方向

李笑櫻，孫鐵虎，郭 杰，陳 博，佟 毅，潘喜春

（1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.吉林中糧生化有限公司（玉米深加工國家工程研究中心），長春 130033；3.中糧集團中糧生化專業(yè)化平臺，北京 100005）

真菌毒素是真菌在適宜溫濕度條件和基質中產生的具有生物活性的次級代謝產物，在糧食及飼料衛(wèi)生學領域又稱為霉菌毒素[1]。目前已知的霉菌毒素有300多種，其中污染范圍較廣、毒性較大的主要有黃曲霉毒素（AF）、玉米赤霉烯酮（ZEA）、脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）、赭曲霉毒素（OTA）、伏馬菌素及T2毒素等。據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織（FAO）估算，全世界每年約有25%的谷物受霉菌毒素污染，約2%的農產品因霉變而失去營養(yǎng)和經濟價值，給農業(yè)帶來嚴重的經濟損失[2]。被霉菌污染的飼料和糧食顏色、氣味發(fā)生改變，脂肪變質，適口性變差，因而動物的采食量下降，影響生長性能；霉菌毒素還會引起動物繁殖功能紊亂，造成繁殖性能降低；降低免疫細胞活性，導致免疫抑制；還可抑制蛋白質和酶的合成，破壞組織細胞結構，損害動物的肝腎、腸道、神經等器官和組織[3-7]。霉菌毒素在動物產品中（如肉蛋奶中）也會有一定殘留，再通過食物鏈對人體造成危害。因此，早期對飼料及食品中的霉菌毒素進行監(jiān)控和防治，從而降低霉菌毒素對畜牧業(yè)的危害、減少經濟損失，對保障消費者身體健康和國家糧食食品安全意義深遠。我國《飼料衛(wèi)生標準》（GB 13078-2017）和《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017）對飼料及原料和食品中各霉菌毒素的最大允許量都制定了嚴格的限制標準。

1 霉菌毒素的檢測方法

霉菌毒素的現有檢測方法主要有兩大類：確認方法和快速方法。確認方法又叫儀器方法，主要基于理化儀器設備，如薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）和各種聯(lián)用技術，如氣質聯(lián)用（GC-MS）、液質聯(lián)用（HPLC-MS）等。儀器分析法因其靈敏度高、結果準確可靠而受到檢測機構的青睞，并作為霉菌毒素的常用確證檢測方法。但這種方法需要較為昂貴的精密設備，配備專業(yè)的實驗操作人員，且檢測樣本成本高、樣品前處理復雜、操作步驟煩瑣，無法滿足基層單位對批量樣品的快速篩查檢測的需求。同時，隨著經濟發(fā)展，糧油食品及飼料相關的貿易流通業(yè)務日益頻繁，各級質量控制部門對于樣品檢測的壓力也越來越大，這就要求對霉菌毒素檢測向快捷準確方向發(fā)展[8-9]。

2 霉菌毒素快速檢測方法

現在較多的快速檢測方法主要基于免疫化學，包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）和免疫層析方法。酶聯(lián)免疫吸附法（ELlSA）的基本原理是將已知的抗原或抗體固定在固相載體上，再用做好標記的酶與底物反應顯色，以此來判斷是否有相應的免疫反應[10]。該法的優(yōu)點是免疫反應特異性強、靈敏度較高、樣品預處理簡便，通過酶標儀讀取檢測結果準確且穩(wěn)定，現已成為最常見的快速檢測飼料和食品中霉菌毒素的方法。

免疫層析法主要通過免疫層析試紙條進行檢測，免疫層析試紙條主要由樣本墊、結合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊及黏性底板等部分組成。試紙條上NC膜固定有測試線和質控線；樣品溶液加入至樣本墊，預先在結合墊上噴涂抗體標記物，樣品溶液通過毛細作用在層析試紙條上移動，經過檢測線時會發(fā)生特異性免疫反應，而游離的抗體標記物進一步與質控線發(fā)生免疫反應，已著色的標記物在短時間（5～10 min）便可顯示出結果；測試線的顯色深淺或吸光度大小進行定性或半定量判定，檢測結果往往存在一定誤差。

市面上的免疫層析試紙條標記物材料依據光譜特性的不同可分為兩類：一類是吸收光譜型材料，包括膠體金、膠體碳、磁珠等；另一類是發(fā)射光譜型材料，包括量子點及量子點微球、熒光微球以及上轉換磷光納米粒子等，其中膠體金免疫層析法應用較為普遍[8]。膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤標志物，利用抗原抗體反應發(fā)明的一種免疫標記技術。膠體金是由氯金酸水溶液在還原劑作用下，聚合成特定大小的金顆粒，顆粒之間因靜電作用形成一種穩(wěn)定的金溶膠狀態(tài)。利用膠體金在堿性環(huán)境中帶負電荷的性質，與蛋白質或其他多種生物大分子物質（如霉菌毒素、抗生素、激素、核酸、多肽綴合物等）的正電荷基團的靜電吸引而形成牢固的結合，這種結合對所標記物質的生物活性卻無顯著影響[11]。

由于霉菌毒素屬半抗原，不具有免疫原性，因此在制備抗體前首先要合成霉菌毒素—載體蛋白結合物免疫原。由于各種霉菌毒素分子結構不同，其在絕大部分情況下不具備連接反應基因，因此霉菌毒素分子首先要經過衍生過程，而衍生所需要一定的連接化學反應條件，這種反應條件一定不能導致其半抗原分子結構發(fā)生改變，之后再通過連接物與載體蛋白連接[11]。常用的載體蛋白有牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA）等。制備好的半抗原結合物在免疫動物前，要測定結合物中半抗原數目，因為結合物中半抗原分子數目太多或太少，都會導致誘發(fā)抗體的能力較差。

基于膠體金為標記材料的免疫層析法生產的霉菌毒素檢測試紙條是目前應用最廣泛的一種快速檢測產品，并已大量應用于AFB1、ZEN、DON以及OTA等霉菌毒素的快速檢測。且該技術由于無需精密儀器、方法簡單快速、成本低廉等優(yōu)點，適用于飼料和糧食現場快檢和大規(guī)模樣品篩查，現已被廣泛應用[12-14]。

3 霉菌毒素膠體金快速檢測方法在實際中的應用

姚佳等以AFB1、DON和ZEN分析了3種毒素膠體金免疫層析快速檢測試紙條的最低檢出限分別為0.005、0.5和0.3 mg·kg-1，通過回收率和變異系數評價了該快檢方法的準確性和精密度，并進一步將該檢測技術應用于寧夏稻米毒素的快速檢測，結果表明，3種毒素的膠體金免疫層析快速檢測試紙條具有較高靈敏度和特異性，并可通過肉眼直接判讀結果的特性，適用于稻米的現場快速檢測[15]。孫清研究了一種可直接檢測油中AFB1的免疫層析方法，其按一定比例混合植物油和純凈水，用免疫層析試紙條檢測，可通過肉眼確認油中的AFB1含量，該方法最低檢測限可達1.5 μg·kg-1，與國標法對比其準確性相對較高[16]。該方法不僅可用于實驗室中糧油AFB1檢測，也可用于家庭中植物油安全檢測。由于近幾年食品安全事件頻發(fā)，牛奶中黃曲霉毒素的快速檢測成為了關注的重點。Wang等研制出一種用于檢測乳及乳制品中的AFM1的納米金免疫層析試紙條，用該試紙條檢測了15種乳及乳制品中AFM1含量，所需時間僅10 min，檢測限為0.028 ng·mL-1，并檢測出其中6種乳及乳制品受到輕微的AFM1污染，發(fā)現所有樣品中AFM1含量均＜1 ng·mL-1[17]。

以上列舉應用多為定性檢測，這些檢測因肉眼觀察主觀性較強，檢測結果重復性也相對較差。近年來隨著各種技術手段綜合應用，多學科之間交叉滲透，膠體金層析快速檢測技術也有了較大的改進和提高。

王海彬成功研制出黃曲霉毒素膠體金免疫層析速測儀，該速測儀結合光、機、電、計算機等技術手段，膠體金免疫層析試紙條作為一級傳感器，面陣CMOS圖像芯片作為二級傳感器，將黃曲霉毒素免疫層析快速檢測試紙條的定性結果進行快速量化讀取，獲取待檢測黃曲霉毒素的定量信息，從而對黃曲霉毒素進行快速定量檢測，檢測花生樣品結果表明，加標回收率為88%～119%，相對標準偏差（RSD）分布為6%～27%，快速定量檢測結果與高效液相色譜法比對后發(fā)現兩種方法相對誤差≤17%，同時還建立了花生中黃曲霉毒素總量（B1+B2+G1+G2）的快速定量檢測技術[18]。張兆城等研發(fā)了花生、玉米、大米、小麥等糧油農產品中黃曲霉毒素總量、AFM1和AFB1高靈敏、高特異性系列檢測技術，同時研制了系列配套試紙條和黃曲霉毒素單光譜成像檢測儀和黃曲霉毒素流動滯后免疫時間分辨熒光檢測儀[19]。王督等研發(fā)的檢測花生、玉米、大米、小麥等糧油農產品中黃曲霉毒素B1的定量分析方法，檢測結果表明，4種樣品檢測的線性范圍為1.0～20.0 μg·kg-1，r2＞0.97，方法的定量限為1.0 μg·kg-1，樣品加標回收率為75%～106%，RSD＜20%，且此法與免疫親和柱凈化-HPLC法相比，相對誤差＜15%，樣品檢測時間只需15 min，檢測成本也低于其他方法[12]。

王瑩等通過合成玉米赤霉烯酮（ZEN）人工抗原，制備抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體（mAb），并以此為基礎建立膠體金免疫層析檢測試紙，與膠體金讀數儀配合使用，用于快速定量檢測玉米和小麥樣品中ZEN，結果表明，檢測的玉米和小麥樣品，ZEN的檢測限為4.7 μg·kg-1，定量限13.9 μg·kg-1，線性范圍 14.5～500 μg·kg-1，相關系數 r=0.996 4，用高效液相色譜法進行比對，發(fā)現快檢方法檢測樣品的準確度為80.1%～149.7%，變異系數范圍7.3%～19.6%，并用配對t檢驗分析，表明兩種方法之間無顯著性差異[20]。宋青龍等應用膠體金免疫層析技術和定量讀數儀技術研制出一種快速定量檢測谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測試劑盒，該試劑盒以膠體金標記高特異性單抗，與偶聯(lián)抗原進行正交試驗，確定適宜條件，同時通過與對照線和試驗線的顏色對比，應用膠體金定量讀數儀，對樣本中黃曲霉毒素B1含量進行定量檢測，結果表明，黃曲霉毒素B1膠體金快速定量檢測試劑盒檢測方法便捷、穩(wěn)定，檢測結果可定量，避免了人眼判別的差異，且與常見霉菌毒素無交叉反應，樣品檢測結果與高效液相色譜法檢測結果的相對誤差＜20%[21]。

對市面上幾款膠體金免疫層析產品進行調研，發(fā)現這些產品大多也有配套的分析檢測儀，儀器中有樣品檢測標準曲線，可快速讀取檢測樣品中霉菌毒素含量。檢測樣本量沒有特殊要求，既可檢測單個或少量樣本，也可檢測大量樣本?？蓹z測基質成分較為單一的原料樣品（如糧食、油料、飼料原料等）也可檢測基質成分較為復雜的樣本（如酒糟、糧食發(fā)酵產品、成品飼料等），前處理過程安全快捷，無需對檢測提取液進行pH調節(jié)，可用于實驗室霉菌毒素快速檢測。另外，配套的定量檢測儀器可通過網絡自動進行標準曲線讀取、數據傳輸、軟件升級、問題故障診斷、質量控制等。對使用這些快檢產品的客戶進行調研，發(fā)現這些快檢產品在實際應用中存在一些缺陷；膠體金層析試紙條生產廠家生產過程質控不嚴，讀數儀對快檢卡顏色深淺不敏感導致檢測結果偏差較大，檢測環(huán)節(jié)和快檢卡本身受檢測環(huán)境溫度濕度影響較大，沒有配套完善的儀器確認方法，數據溯源上傳功能故障頻發(fā)，檢測卡成本過高等，問題還有待解決。

4小 結

免疫層析試紙條因操作步驟簡便、檢測快速、無需昂貴大型儀器等特點，在批量樣品的快速篩查方面具有極大的優(yōu)勢和廣闊的應用前景，已廣泛應用于糧油及飼料中霉菌毒素的快速檢測[22]。隨著其他新型標記材料的應用，今后將會進一步提高免疫層析方法的檢測準確性和精確性。另外，霉菌毒素在糧油和飼料中通常多種共存，建立對多種毒素的快速、高通量檢測技術，將大大節(jié)約成本，提高檢測效率，因此基于免疫層析平臺的多種毒素檢測技術也必將成為今后的發(fā)展方向之一。霉菌毒素除了在糧食和飼料中存在以外，在其他食品飲品領域（如發(fā)酵類食品、茶葉、菌糠等）同時存在安全隱患，未來對這些領域中霉菌毒素的檢測也應該得到重視[23]。各級衛(wèi)生部門和食品安全管理部門應重視霉菌毒素的風險評估和監(jiān)測預警等工作，建立霉菌毒素快速檢測標準。相關管理部門應預防嚴控食品的來源、加工、銷售等環(huán)節(jié)，精準掌握其中霉菌毒素數據信息，綜合管控治理。同時引導幫助廣大消費者樹立食品安全意識和正確解讀國家相關標準法規(guī)，引導消費者購買安全、健康、綠色的食品[24]。