海帶發(fā)酵降解的復(fù)合菌種篩選及海藻寡糖產(chǎn)物的檢測(cè)

陳 營，孫業(yè)梅，楊丹丹，郭 琳

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東煙臺(tái) 264005)

海帶(Laminariajaponica)又名昆布，是生長于海洋中的大型褐藻，歸屬于光能自養(yǎng)型微生物[1]，是我國歷史最悠久的食用及藥用藻類之一。我國的褐藻資源豐富，海帶在我國北部及東南沿海地區(qū)均有大量養(yǎng)殖，是養(yǎng)殖規(guī)模最大的重要經(jīng)濟(jì)藻類，具有獨(dú)特的工業(yè)和食用價(jià)值。海帶常年生長在低溫的環(huán)境中，生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)，藻體中含有大量陸生生物不具有的營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分[2]，作為植物生物刺激素在農(nóng)業(yè)中有著廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景[3]。

以海帶為主要原料制備海藻肥料，通常采用化學(xué)、物理和生物的方法提取海帶的有效成分，其中的標(biāo)志性物質(zhì)是海藻酸。海藻酸是一種酸性大分子的多糖物質(zhì)，占藻體干質(zhì)量的22%～44%[4]。當(dāng)海藻酸以高聚合度的大分子狀態(tài)存在時(shí)，黏度大、吸收利用差等特性限制了其應(yīng)用的范圍[5]。同時(shí)，海藻酸構(gòu)成了海帶、馬尾藻、巨藻等褐藻細(xì)胞壁的主要成分，也是藻體細(xì)胞間骨架的基質(zhì)[6]。經(jīng)過提取處理后，海帶藻體結(jié)構(gòu)被破壞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的全部營養(yǎng)物質(zhì)。而海藻酸或其黏度降低，或變成小分子海藻寡糖，水溶性和吸收度增大，呈現(xiàn)更多的生物活性作用，如植物生長的刺激作用和植物抗病力的誘導(dǎo)效應(yīng)[2]。在海藻的各種提取方法中，生物法因其條件溫和可控、特異性強(qiáng)、綠色無污染，日益受到人們的重視。因此，篩選海帶降解菌或降解酶，最大程度地保證海藻有效成分的完整性，對(duì)海藻提取物的應(yīng)用是至關(guān)重要的[3]。目前，大部分的海帶降解菌或降解酶都源于海洋細(xì)菌，如弧菌(Vibrio)[5，7-9]、交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)[10-11]、交替單胞菌(Alteromonas)[12]、芽孢桿菌(Bacillus)[13]、Shewanella[14]、Tamlana[15]。生物法的優(yōu)勢(shì)除了反應(yīng)溫和、無營養(yǎng)損失外，其產(chǎn)物也獨(dú)具特殊性。海藻酸經(jīng)過微生物酶的裂解后，其產(chǎn)物海藻寡糖的非還原端C4與C5間會(huì)產(chǎn)生一個(gè)雙鍵，在波長235 nm處有最大吸收峰，通過比色法可以測(cè)定海藻寡糖的含量[16]。由此制備的非飽和寡糖具有生物學(xué)活性，而由其他方法制備的飽和寡糖則不具有[10]。

本文從實(shí)驗(yàn)室保存的海帶降解菌群中分離純化出相關(guān)的海帶降解菌，通過分析菌種之間的相互作用，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中海藻寡糖的組成和含量，篩選并重新組成復(fù)合微生物菌種，用于海帶發(fā)酵降解制備海藻寡糖的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品，購于煙臺(tái)本地市場(chǎng)的干海帶；菌種，本實(shí)驗(yàn)室保存于海帶發(fā)酵液中的海帶降解菌群；培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)基等參考文獻(xiàn)[17]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

VD-850型桌上式潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TG16-W型微量高速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LDZX-40BⅠ型立式全自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠；HZQ-F160型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；UV-1900型紫外-可見分光光度計(jì)，翔藝儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 海帶降解菌群的活化及分離純化

取保存的海帶發(fā)酵液，按5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種至富集培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min下培養(yǎng)至海帶片90%以上分解。繼續(xù)傳代培養(yǎng)2次，直至海帶分解效果穩(wěn)定。取海帶降解液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，涂布牛肉膏蛋白胨平板。待平板上有菌落生長后，選取形態(tài)不同的菌落反復(fù)幾次劃線培養(yǎng)，純化后的菌種留待備用。

1.3.2 微生物菌種之間的相互作用分析

(1)交叉劃線法[18]。 將純化的菌種兩兩之間在牛肉膏蛋白胨平板表面交叉劃線，培養(yǎng)后在兩種菌交叉的地方觀察細(xì)菌生長情況。交叉處細(xì)菌的生長如果優(yōu)于單一劃線處的細(xì)菌，說明兩種菌之間有相互促進(jìn)的作用；反之，說明細(xì)菌之間沒有相互促進(jìn)作用。

(2)濾紙片法[19]。先選擇一種菌液涂布于平板表面，然后將滅菌的濾紙片浸入其他的菌懸液中，待濾紙片微干后貼于培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)后觀察濾紙片周圍細(xì)菌的生長情況。若濾紙片周圍的細(xì)菌生長得更好，說明兩細(xì)菌之間有相互促進(jìn)作用；反之，則無作用。

1.3.3 海帶的混合發(fā)酵與海藻寡糖含量的測(cè)定

取純化的菌種，以等比例混合接種至富集培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r/min下培養(yǎng)4 d。以各自單一菌種接種富集培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基作對(duì)照，每組均為兩個(gè)平行。發(fā)酵結(jié)束后，取各自海帶發(fā)酵液以4 000 r/min離心10 min，再取上清液稀釋40～50倍，在波長235 nm下測(cè)定吸光度，即可比較各發(fā)酵液中海藻寡糖含量的差異，從而確定海帶分解的效果。

1.3.4 海帶發(fā)酵復(fù)合菌種的比例分析

從上述海帶的混合發(fā)酵中，選取海帶分解達(dá)到90%以上和海藻寡糖含量較高的組合，采用平板培養(yǎng)法對(duì)最終發(fā)酵液中的菌種計(jì)數(shù)，確定混合發(fā)酵的接種比例。

1.3.5 復(fù)合菌種發(fā)酵產(chǎn)物的薄層層析

薄層層析所用展開劑為正丁醇∶乙酸乙酯∶異丙醇∶冰乙酸∶水(2∶6∶6∶4∶1)。將點(diǎn)樣的硅膠板放于盛有展開劑的層析缸中，在50 ℃下待樣品擴(kuò)散至距硅膠板頂端約1 cm處，取出在70 ℃烘烤30 min。 烘干后，均勻噴體積分?jǐn)?shù)為30%的硫酸溶液進(jìn)行顯色，并在110 ℃烘烤10 min后觀察。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的葡萄糖、蔗糖溶液作為對(duì)照。

1.3.6 混合發(fā)酵復(fù)合菌種的鑒定

試驗(yàn)采用煮沸法提取細(xì)菌基因組，并進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定。PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶降解菌的分離和純化

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的海帶發(fā)酵液進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，在37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)3～4 d，海帶分解達(dá)到90%以上。這是一個(gè)海帶降解菌群的富集培養(yǎng)液，經(jīng)過近3年的保存，其混合菌群的種類逐漸變少，但降解海帶的效果仍然很好。經(jīng)平板涂布分離及劃線純化后，共獲得3種不同菌落形態(tài)的菌株，分別命名為Lj1、Lj2和Lj3。

2.2 微生物菌種之間的相互作用

在交叉劃線試驗(yàn)中，Lj1和Lj2交叉劃線處的細(xì)菌生長優(yōu)于單菌生長，兩菌株之間可能存在相互促進(jìn)作用；Lj2和Lj3交叉劃線處的細(xì)菌生長較差，不如單菌生長，兩菌株之間可能有抑制作用；Lj1和Lj3之間的關(guān)系不是很明顯。

在交叉劃線試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行濾紙片法分析，先將Lj2涂布于平板上，再將浸有Lj1和Lj3 的濾紙片貼在平板表面。結(jié)果表明：Lj2的代謝產(chǎn)物促進(jìn)了Lj1的生長，進(jìn)一步確定了兩者之間的協(xié)同作用；Lj2和Lj3之間作用不明顯或沒有促進(jìn)作用。

2.3 海帶發(fā)酵復(fù)合菌種的篩選

經(jīng)過檢測(cè)混合發(fā)酵液中海藻寡糖的含量，以Lj1+Lj2組合的含量最高，稀釋50倍后的平均吸光度為0.784，其次為Lj1+Lj3和Lj2+Lj3組合。3種菌株的組合和單一菌株發(fā)酵液中，海藻寡糖含量均較低，與空白對(duì)照相當(dāng)，結(jié)果見圖1。

圖1 海帶發(fā)酵液中海藻寡糖含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)合海帶的分解效果，也是Lj1+Lj2組合中的海帶分解最好，在3～4 d可使質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的濕海帶分解率達(dá)90%以上。因此，選用Lj1+Lj2組合作為海帶發(fā)酵降解的復(fù)合菌種。

2.4 海帶發(fā)酵的復(fù)合菌種鑒定、菌種比例及產(chǎn)物組成

利用Lj1+Lj2復(fù)合菌種發(fā)酵海帶，起始接種時(shí)兩者是等比例混合。由于兩者之間的偏利共生關(guān)系，即Lj2促進(jìn)Lj1生長的現(xiàn)象，經(jīng)過3～4 d的混合培養(yǎng)，在發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)平板計(jì)數(shù)，最終Lj1和Lj2的活菌數(shù)比例變?yōu)?∶2。這個(gè)比例是兩者在海帶中的最佳比例，也應(yīng)該是發(fā)酵起始接種的合適比例。

復(fù)合菌種分別經(jīng)細(xì)菌16S rDNA測(cè)序鑒定，Lj1為印度斯塔普氏菌(Stappiaindica)，Lj2為陶氏假單胞菌(Pseudomonastaeanensis)。斯塔普氏菌是一種不常見的細(xì)菌，而假單胞菌在自然界中廣泛存在，對(duì)各種碳源物質(zhì)的利用種類最多、能力最強(qiáng)。

通過薄層層析對(duì)海帶發(fā)酵液中海藻寡糖種類進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，海帶發(fā)酵液的層析斑點(diǎn)完整、不拖尾，在蔗糖附近略靠下的位置。由此可以推測(cè)海帶發(fā)酵液中的海藻寡糖大致為單一組分的三糖，見圖2。

圖2 海帶發(fā)酵液的薄層層析分析

3 結(jié)語

海帶的細(xì)胞壁組成十分復(fù)雜，含有海藻酸和其他的多糖成分，這些可以成為微生物生長繁殖的營養(yǎng)物質(zhì)和能源[20]。只有能利用這些物質(zhì)的微生物才能將其降解成小分子，破壞細(xì)胞壁的保護(hù)結(jié)構(gòu)，釋放出細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)。因此，利用不同菌種的代謝酶系，可以更好地協(xié)同作用，更快、更有效地降解海帶。從實(shí)驗(yàn)室保存的海帶降解菌群中共獲得3株細(xì)菌，通過分析兩種不同方法的菌種之間的相互作用，得出Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis之間有協(xié)同促進(jìn)作用；對(duì)不同菌種組合的海帶發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行235 nm光吸收檢測(cè)，也表明這兩個(gè)菌種組合產(chǎn)生的海藻寡糖含量最高，分解海帶的效果最好，而任一單菌種或其他組合效果都不好。所以，后續(xù)的研究選用Stappiaindica和Pseudomonastaeanensis作為海帶發(fā)酵降解的復(fù)合菌種。Sun等[21]在海帶的表面分離到一株細(xì)菌Bordetellasp. HZ20，這株菌沒有分解海帶的能力，但可能具有分解幾丁質(zhì)和聚羥基脂肪酸酯(PHA)酶系的能力，與其他菌共同參與碳、氮、磷、硫的代謝，這或許是該菌在海帶表面生態(tài)系統(tǒng)中存在的意義。

試驗(yàn)分離的假單胞菌是自然界中利用碳源物質(zhì)能力最強(qiáng)的細(xì)菌，如海帶含有的各種多糖。在與斯塔普氏菌混合發(fā)酵海帶的過程中，假單胞菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物促進(jìn)Stappiaindica的生長，兩者共同作用使海帶降解。Stappiaindica在這個(gè)過程中可能具有獨(dú)特針對(duì)海帶中某種成分的利用和分解能力，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。此復(fù)合菌種在4 d之內(nèi)可使質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的濕海帶幾乎全分解，而且產(chǎn)物經(jīng)薄層層析推測(cè)為單一的三糖。柏超[15]從海帶降解菌群中分離到兩株高效降解菌株，其中假單胞菌具有淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和海藻酸裂解酶活性，Tamlana具有海藻酸裂解酶活性。利用這兩株菌的重新組合，只需要5 d就可以把培養(yǎng)基中質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的海帶塊完全降解。姚艷艷等[8]利用弧菌 YY7 菌株發(fā)酵液降解海帶粉，酶解6 h的降解率可達(dá) 65% 以上。湯海青[10]通過薄層層析推測(cè)由海藻酸裂解酶制備的產(chǎn)物為寡糖混合液，各寡糖的聚合度為2～9，其中以聚合度2～6的寡糖為主，酶解的終產(chǎn)物為二糖和三糖?？梢姡瑥牟煌h(huán)境分離的菌株，降解海帶的能力不同。菌種的組合不同、反應(yīng)條件不同，對(duì)海帶的降解效率和產(chǎn)物組成是有差異的。為實(shí)現(xiàn)海帶發(fā)酵降解的工業(yè)化生產(chǎn)，后續(xù)還將進(jìn)行菌種的穩(wěn)定性和發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究。同時(shí)，亟待建立檢測(cè)海藻寡糖的方法并制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。