基于功能性核酸的重金屬離子檢測技術(shù)

張立佩 魏曉奕 王俊海 李婷

摘 要：功能核酸是一段體外獲得的可與相應(yīng)的靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，具有易合成、易修飾、靶分子范圍廣等特點(diǎn)，近年來在重金屬檢測方面逐漸受到關(guān)注。本文簡要綜述了基于功能核酸實(shí)現(xiàn)重金屬離子檢測的幾種常見類型，分別介紹了其檢測原理及分析對象，并簡單分析了檢測技術(shù)的優(yōu)勢和局限。

關(guān)鍵詞：功能性核酸;重金屬;傳感

0 引言

隨著城市化和工業(yè)化的迅速發(fā)展，我國重金屬污染處于高發(fā)態(tài)勢。重金屬污染具有毒性大、致毒量低、易累積、難降解、難治理等特點(diǎn)。通常，較低濃度的重金屬就能嚴(yán)重害人體健康，包括抑制發(fā)育，引發(fā)癌癥、器官病變、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等，甚至?xí)?dǎo)致死亡。其中，鎘、汞、鉛、砷、鉻等重金屬的污染最為常見而又毒性較大。近年來，全國每年都有許多自來水廠因水源地遭受重金屬污染而被迫減產(chǎn)或停產(chǎn)，嚴(yán)重影響了公眾健康和社會(huì)穩(wěn)定。隨著人們對重金屬危害的認(rèn)識日益深入，強(qiáng)制開展水環(huán)境，特別是飲用水源地中的重金屬檢測已在世界范圍內(nèi)達(dá)成共識。因此，發(fā)展痕量重金屬的檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 傳統(tǒng)重金屬檢測方法

原子熒光光譜分析法（AFS）、原子吸收分光光度計(jì)法（AAS）和電感耦合等離子體質(zhì)譜分析法（ICP-MS）是水環(huán)境及食品中痕量汞、銅、鋅、鎘和鉛等重金屬離子檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法具有精密度高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)長，需要專業(yè)技術(shù)人員操作，檢測費(fèi)用高，常規(guī)檢測次數(shù)有限;另外這些方法依賴大型實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備，很難實(shí)現(xiàn)快速、實(shí)時(shí)檢測樣品的實(shí)際需要。因此，科研工作者希望繼續(xù)尋求一些簡單、快速、靈敏的重金屬離子檢測技術(shù)。

2 功能性核酸重金屬檢測方法

功能核酸是一類新的具有高選擇性的功能識別分子，它是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponentional ?enrichment，SELEX）體外篩選出來的能特異結(jié)合特定靶分子的寡聚核苷酸片段，具有易合成、高特異性、強(qiáng)親和力、高靈敏度、低成本、快速準(zhǔn)確、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)[1]。大量研究表明，在分子水平上某些重金屬離子可與特定的基因序列發(fā)生作用，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而這種結(jié)構(gòu)和性能的改變?yōu)橹亟饘匐x子的快速、特異性識別提供了一條便捷的途徑。本文介紹幾種常見的利用功能核酸實(shí)現(xiàn)重金屬離子檢測的傳感方法。

2.1 核酸適配體（Aptamer）

核酸適配體是一段人造的單鏈DNA、RNA或者多肽分子，能夠與目標(biāo)金屬通過氫鍵、范德華力或堿基配對等進(jìn)行特異性結(jié)合，使其折疊成特定的二級或三級結(jié)構(gòu)。目前已報(bào)道的主要有Zn2+、Pt2+、Cd2+和As3+等重金屬離子的核酸適配體。例如Wu等[2]將生物素--鏈霉親和素系統(tǒng)運(yùn)用到SELEX技術(shù)中，既篩選出Cd2+的特異性核酸適配體，同時(shí)解決了金屬離子在固相表面的結(jié)合固定問題，該法對Cd2+的檢測具有很好的選擇性和高靈敏度。

2.2 脫氧核酶（DNAzyme）

脫氧核酶是一類利用體外篩選技術(shù)獲得的人工脫氧核糖核酸酶，其實(shí)質(zhì)是一段單鏈DNA充當(dāng)類似蛋白酶催化活性的功能和識別能力。在特定重金屬離子存在下，重金屬離子可以作為輔助因子，激發(fā)DNAzyme的催化活性，發(fā)生水解斷裂反應(yīng)。以對Pb2+有較高選擇性的8-17 DNAzyme為例，它由底物鏈和核酸酶鏈結(jié)合而成，是一類含有RNA堿基切割位點(diǎn)的DNA復(fù)合物。當(dāng)Pb2+存在時(shí)，8-17 DNAzyme催化水解底物鏈上RNA底物磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核糖核酸腺苷（rA）處發(fā)生斷裂。目前基于脫氧核酶催化功能的傳感設(shè)計(jì)思路已經(jīng)用于多種重金屬的單指標(biāo)甚至多指標(biāo)的同時(shí)測定[3]。

2.3 G-四連體（G4）

富含鳥嘌呤（G）堿基的寡核苷酸序列在金屬離子作用下，四個(gè)G堿基以旋轉(zhuǎn)對稱的方式排布，在平面邊緣以氫鍵配對的方式形成一個(gè)G-平面，多個(gè)G-平面進(jìn)而堆積形成G-四連體。一些選擇性的金屬離子，如K+、Na+和Pb2+等，可以嵌入到G-四連體結(jié)構(gòu)中，使其更穩(wěn)定的存在。這種金屬離子穩(wěn)定G-四連體結(jié)構(gòu)的性質(zhì)已被大量運(yùn)用于上述金屬離子的檢測。如Li等[4]成功合成了一種帶正電的水溶性9，10-二苯乙烯基蒽季銨鹽衍生物（BTAESA）為熒光探針1，該探針能夠測定出ssDNA的濃度、長度，及其S1核酸酶和酶抑制劑。同時(shí)利用富含鳥嘌呤（G）的凝血酶核酸適體（TBA）與鉛離子（Pb2+）結(jié)合誘導(dǎo)形成G4聯(lián)體結(jié)構(gòu)的這種構(gòu)象變換機(jī)理，并結(jié)合核酸酶S1對不同構(gòu)象核酸適體水解能力的差異性，實(shí)現(xiàn)了基于探針1的新型鉛離子熒光核酸適體傳感器技術(shù)。

2.4 T-Hg2+-T和C-Ag+-C

核酸共價(jià)修飾量子點(diǎn)探針對Hg2+的檢測研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+和Ag+可分別與DNA中的胸腺嘧啶堿基（T）和胞嘧啶堿基（C）特異性結(jié)合，形成T-Hg2+-T和C-Ag+-C錯(cuò)配結(jié)構(gòu)。基于此性質(zhì)，不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的檢測分析方法被用于Hg2+和Ag+的檢測中。例如Huang等[5]合成了發(fā)熒光的Mn：CdS/ZnS量子點(diǎn)，并共價(jià)偶聯(lián)了一條富含T的33個(gè)堿基的DNA鏈，同時(shí)合成了與其互補(bǔ)的含有10個(gè)堿基的單鏈DNA并與納米金共價(jià)偶聯(lián)。當(dāng)無Hg2+存在時(shí)，由于互補(bǔ)效應(yīng)拉近了納米金與量子點(diǎn)的距離，發(fā)生FRET，使量子點(diǎn)熒光猝滅;當(dāng)有Hg2+存在時(shí)，基于T-Hg2+-T錯(cuò)配原理，Hg2+可以與33堿基反應(yīng)使其折疊呈雙鏈結(jié)構(gòu)，從而破壞了與10堿基單鏈DNA的互補(bǔ)效應(yīng)，拉大了納米金與量子點(diǎn)的距離，量子點(diǎn)熒光重新恢復(fù)，由此可以實(shí)現(xiàn)Hg2+的檢測，該傳感的機(jī)理圖如圖1所示。

3 結(jié)語

基于功能核酸的重金屬離子檢測技術(shù)近幾年發(fā)展迅猛，但其發(fā)展尚處于初級階段。目前可用的功能核酸的種類較少，如何篩選分離出更多高特異性的功能核酸還有待于各學(xué)科的共同努力。此外，功能核酸受環(huán)境條件影響較大，因此需要合理的修飾與保護(hù)，使其少受基質(zhì)干擾，這也是以后功能核酸需要解決的一個(gè)問題。

參考文獻(xiàn)：

[1] Robertson DL， Joyce GF. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves singlestranded DNA[J]. Nature，1990（344）：467-468.

[2] Wu Y， Zhan S， Wang L， Zhou P. Selection of a DNA aptamer for cadmium detection based on cationic polymer mediated aggregation of gold nanoparticles [J]. Analyst，2014（139）：1550-1561.

[3] Ravikumar A， Panneerselvam P， Padhakrishnan K. Fluorometric determination of lead（I） and mercury（II） based on their interaction with a complex formed between graphene oxide and a DNAzyme [J]. Microchimica Acta，2018（185）：2-8.

[4] Li X， Ma K， Xu B， et al. Highly sensitive determination of ssDNA and real-time sensing of nuclease activity and inhibition based on the controlled self-assembly of a 9， 10-distyrylanthracene probe [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2014，406（3）：851-858.

[5] Huang D W，Niu C G，Wang X Y，et al.“Turn-on”fluorescentsensor for Hg2+ based on single-stranded DNA functionalized Mn： CdS/ZnS Quantum dots and gold nanoparticles by time-gated mode [J]. Analytical Chemisty，2013，85（2）：1164-1170.

作者簡介：

張立佩（1983- ），女，漢族，河北石家莊人，沈陽建筑大學(xué)講師，博士，主要從事新型納米材料生物傳感方法的構(gòu)建。

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（lnqn201915）。