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    苦參有效部位對(duì)人參黑斑病菌的抑菌研究

    2020-12-28 03:04:33王彩云陸承雙常豐華
    南方農(nóng)業(yè)·中旬 2020年10期
    關(guān)鍵詞:總黃酮苦參

    王彩云 陸承雙 常豐華

    摘 要 采用超聲波提取工藝獲取苦參總生物堿,用藥物二倍稀釋法與菌落抑制率公式觀察計(jì)算苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌的抑菌作用,并測(cè)定用藥時(shí)的抑菌濃度范圍;同時(shí)采用孢子萌發(fā)法和生長(zhǎng)速率法,對(duì)苦參中總黃酮提取物對(duì)人參黑斑病菌的抑制效果進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:不同苦參總生物堿濃度對(duì)人參黑斑病菌絲和孢子均具有抑制作用,在苦參總生物堿濃度為10 mg·mL-1及以上時(shí)與空白對(duì)照組相比,對(duì)人參黑斑病菌絲的抑制率為98.8%,孢子的抑制率為100%。苦參總黃酮溶液含量達(dá)到0.1 g·mL-1(10%)時(shí),抑菌效果最佳。

    關(guān)鍵詞 苦參;總生物堿;總黃酮;人參黑斑病

    中圖分類號(hào):R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.29.076

    苦參為豆科植物苦參(Sophora flavescens Ait.)的干燥根,味極苦。其主要藥用成分為苦參堿和氧化苦參堿[1],其重要化學(xué)成分還有黃酮類[2]。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    人參黑斑病菌從吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院人參種植基地患有黑斑病的人參葉片上培養(yǎng)分離取得。

    培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(用于制藥敏瓊脂培養(yǎng)基,承接分離純化的黑斑病菌和盛放不同濃度的苦參總黃酮溶液)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    超聲波提取機(jī)、鼓風(fēng)干燥箱、精密恒溫水浴鍋、醫(yī)用離心機(jī)、循環(huán)水式多用真空泵、密封型手提式粉碎機(jī)、萬(wàn)分之一電子天平、生物顯微鏡、冷藏柜、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、手提式壓力蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 苦參總生物堿的提取

    取苦參根部,洗凈曬干,切片粉碎,稱取100 g粉末,苦參藥材粗粉以10倍量的0.2%鹽酸溶液進(jìn)行超聲波提取,控制提取條件為時(shí)間40 min,功率500 W[3-4]。提取液用紗布初過(guò)濾后,取得濾液,在離心轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1的離心機(jī)上離心5 min后,取得上清液,在上清液中加入3%的氫氧化鈉,調(diào)pH值為8.5[5],靜置,析出沉淀,干燥備用。

    1.2.2 苦參總黃酮提取及溶液的制備

    用粉碎機(jī)將苦參飲片粉碎,得苦參細(xì)粉,并稱取50 g,用濾紙將其包好放置于索式提取器的提取管中,再向燒瓶中加入95%的乙醇溶液,通冷凝水,加熱回流,連續(xù)提取6 h,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)提取液進(jìn)行濃縮[6],然后使用柱層析法對(duì)濃縮液中的總黃酮進(jìn)行分離[7],得到較純的苦參總黃酮溶液,再使用95%的乙醇對(duì)分離得到的總黃酮溶液進(jìn)行定容,使溶液濃度為5 g·mL-1,最后將溶液分裝于10 mL具塞試管中,密封,置于4 ℃的冰箱內(nèi)保存,備用。

    1.2.3 人參黑斑病菌的分離與培養(yǎng)

    1)取高溫滅菌后的培養(yǎng)皿,在超凈工作臺(tái)中倒入已滅菌的PDA培養(yǎng)基20 mm,待冷凝后制作成平板,放入冷藏柜備用。

    2)采集人參種植基地出現(xiàn)黑斑病病斑的人參葉片,用流水沖洗數(shù)遍。于無(wú)菌環(huán)境下,切下帶有人參黑斑病菌的病斑葉片數(shù)塊,并把病斑葉片放入70%乙醇溶液中消毒2~3 s,再放入0.1%的升汞溶液中消毒30 s,最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次,并用滅菌后的吸水紙除去葉片上的水分,減少細(xì)菌滋生。將葉片置于PDA培養(yǎng)基平板上,每個(gè)PDA培養(yǎng)基平板放4~6塊,然后把培養(yǎng)皿倒置于電熱恒溫培養(yǎng)箱中,在25 ℃下培養(yǎng)4~7 d。數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)狀況,最后將分離純化的菌株保存于PDA斜面上,置4 ℃冰箱備用[8]。

    1.2.4 采用二倍遞減稀釋法稀釋苦參總生物堿和總黃酮

    苦參總生物堿分別配制成40 mg·mL-1、20 mg·mL-1、10 mg·mL-1、5 mg·mL-1、2.5 mg·mL-1、1.25 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、0.312 5 mg·mL-1、0.156 3 mg·mL-1共9個(gè)不同濃度的供試藥液。

    苦參總黃酮溶液濃度分別為15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%共6個(gè)不同濃度的供試藥液。

    1.2.5 藥敏瓊脂培養(yǎng)基的制備

    1.2.5.1含苦參總生物堿和總黃酮溶液的培養(yǎng)基制備

    用移液槍分別吸取每個(gè)苦參總生物堿供試藥液濃度1 mL,加入已滅菌的培養(yǎng)皿中,再趁熱倒入已滅菌的PDA培養(yǎng)基20 mL,順時(shí)針輕搖晃,保證供試液與培養(yǎng)基混合均勻,制成含供試藥液的培養(yǎng)基[9]。每個(gè)濃度倒3皿,每皿約20 mL,9個(gè)濃度梯度,一個(gè)空白對(duì)照。并按照此方法對(duì)含苦參總黃酮溶液的培養(yǎng)基進(jìn)行制備。

    1.2.5.2苦參總黃酮對(duì)照組和農(nóng)藥處理組PDA培養(yǎng)基的制備

    按照如上方法分別向滅菌的PDA培養(yǎng)基中加入95%的乙醇溶液和濃度為1 200 mg·mL-1的代森錳鋅可濕性粉劑溶液各2 mL。

    1.3 藥敏試驗(yàn)

    1.3.1 各個(gè)濃度的供試藥液對(duì)黑斑病菌絲生長(zhǎng)影響

    人參黑斑病菌培養(yǎng)7 d后,選擇均勻且長(zhǎng)勢(shì)好的菌落,用打孔器打出直徑8 mm的菌餅數(shù)個(gè),分別置于空白組、含苦參總生物堿、含苦參總黃酮溶液、含代森錳鋅農(nóng)藥的供試藥液培養(yǎng)基平板的中心,各個(gè)濃度的供試藥液培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基每個(gè)3皿,每個(gè)培養(yǎng)基各放入一個(gè)菌餅。放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d,并設(shè)定溫度為25 ℃,最后采用十字交叉法來(lái)測(cè)量菌落的直徑,各個(gè)濃度測(cè)量3次,求平均值,用以下公式計(jì)算抑制率[10]。

    1.3.2 各個(gè)濃度供試藥液對(duì)黑斑病孢子萌發(fā)的影響

    人參黑斑病原菌培養(yǎng)孢子7 d后,在超凈工作臺(tái)上選取生長(zhǎng)良好、活力強(qiáng)病菌孢子,用無(wú)菌水配成10倍視野下100~120個(gè)病菌孢子的菌懸液。菌懸液對(duì)供試藥液進(jìn)行稀釋,按計(jì)算好的400 μL中需加入不同濃度的供試藥液量,用菌懸液稀釋至400 μL并加入6孔凹板板孔中,放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后,計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率[11]。

    1.3.3 數(shù)據(jù)分析

    本次抑菌實(shí)驗(yàn)每個(gè)濃度重復(fù)3組,空白對(duì)照一組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

    苦參總生物堿各不同濃度對(duì)人參黑斑病菌絲的生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用,人參黑斑病菌在濃度為10 mg·mL-1及以上的總生物堿供試藥液培養(yǎng)基上,菌絲生長(zhǎng)抑制率為98.8%。具體情況見(jiàn)表1。

    2.2 苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響

    苦參總生物堿不僅可以抑制人參黑斑病菌絲生長(zhǎng),而且還對(duì)黑斑病病菌孢子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)總生物堿藥液濃度為10 mg·mL-1及以上時(shí),孢子萌發(fā)抑制率為100%,具體情況見(jiàn)表2。從表中可以看出,各個(gè)濃度總生物堿藥液對(duì)孢子萌發(fā)均有較好抑制效果,證明總生物堿藥液對(duì)人參黑斑病孢子的生長(zhǎng)有抑制作用。

    2.3 苦參總黃酮對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

    不同濃度苦參總黃酮溶液對(duì)人參黑斑病菌菌絲產(chǎn)生了不同程度的抑制作用,濃度越高,抑菌率越高,濃度在10%時(shí),苦參總黃酮溶液的抑菌率為81.3%,高于農(nóng)藥組,且呈顯著性差異,具體情況見(jiàn)表3。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)屬于人參葉片上黑斑病的室內(nèi)離體試驗(yàn),利用苦參提取物總生物堿對(duì)PDA培養(yǎng)基里的黑斑病菌落進(jìn)行處理,觀察其菌落和孢子是否停止生長(zhǎng)或消失,從而檢測(cè)苦參總生物堿是否對(duì)人參黑斑病有抑菌作用。試驗(yàn)結(jié)果表明,接菌后7 d,5 mg·mL苦參總生物堿藥液處理的菌絲抑制率達(dá)94.4%;5 mg·mL苦參總生物堿藥液濃度處理的孢子萌發(fā)抑制率為96.5%。在濃度為10 mg·mL及以上時(shí)與空白對(duì)照組相比,菌絲的抑制率為98.8%,孢子的抑制率為100%??鄥⒖傸S酮對(duì)人參黑斑病菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果表明,濃度為10%及以上的苦參總黃酮溶液對(duì)人參黑斑病菌的抑菌效果最佳。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,苦參總生物堿及總黃酮對(duì)人參黑斑病菌絲生長(zhǎng)有抑制效果,苦參總生物堿對(duì)人參黑斑病孢子萌發(fā)也有一定抑制效果,這為研發(fā)新型植物源農(nóng)藥奠定了基礎(chǔ),可降低了農(nóng)藥大量使用對(duì)環(huán)境造成的污染。

    參考文獻(xiàn):

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    (責(zé)任編輯:趙中正)

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