一種基于萘酰亞胺神經介質模擬物熒光增強型探針

趙磊 陳康 程探宇

摘要：神經毒劑，如沙林、梭曼和塔崩等都是劇毒的有機磷化合物，可以用作化學武器，主要是抑制乙酰膽堿酶的活性，進而引起神經系統(tǒng)的紊亂，所以快速方便地檢測此類化合物具有重要的意義.設計并合成了一種以萘酰亞胺為熒光團、肼基作為活性基團的快速響應熒光探針（PND），該探針可用于檢測神經毒劑模擬物：氯磷酸二乙酯（DCP）和氰基磷酸二乙酯（DCNP），而且表現出了高選擇性和高靈敏度.

關鍵詞：熒光探針;萘酰亞胺;水合肼;神經性毒劑

中圖分類號：0 657.34

文獻標志碼：A

文章編號：1000-5137（2020）02-0184-07

0引 言

神經毒劑，沙林、梭曼、塔崩等是一類具有致命劇毒性的有機磷化合物，如圖1所示，可用作化學武器等，其毒性高、致命快的特點，對人體安全構成了威脅[1-2].神經毒劑生產成本低，簡單易得，且廣泛使用[3-5].這些無色無味的毒劑形式多樣，主要有氣體、氣溶膠或液體等形式，很容易被動物和人類吸人，或通過皮膚接觸吸收，導致死亡，雖然一些國際條約禁止發(fā)展、生產和儲存化學武器，但一些國家仍在對其進行研究[2，5-6].神經毒劑進入人體的作用機制主要是抑制蛋白酶的活性，尤其是乙酰膽堿酯酶的活性，乙酰膽堿酯酶是人體內的中樞神經酶，神經毒劑與膽堿酯酶結合成穩(wěn)定的磷?；憠A酯酶，使膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的活性，導致乙酰膽堿在神經突觸連接處的過度積累，會造成肌肉松弛障礙、神經紊亂甚至死亡，因此，對于神經毒劑的檢測變得尤為重要[7-10].2016年，KIM等iiii報道了一種熒光探針o-OH檢測神經毒劑模擬物氯磷酸二乙酯（DCP），如圖2所示，該熒光探針o-OH能夠檢測和定量固定在固體基質上的溶液和氣相中的有機磷神經毒劑模擬物，通過抑制反應性酚醛酸磷酸化后的內旋，從而產生較強的熒光“打開”響應，探針o-OH在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中熒光信號很弱，熒光量子產率（ΦF）為0.002，與DCP作用以后，得到探針o-Ophos，探針o-Ophos在DMF中表現出很強的熒光信號，ΦF為0.490，具有選擇性好、靈敏度高、熒光信號變化明顯等優(yōu)點.

由于神經毒劑的毒性大且生產方便，發(fā)展高靈敏度和高選擇性的檢測方法已成為該領域的一個研究熱點，目前，基于電位法、表面聲波光譜法、酶法、電化學、氣相色譜/質譜法等方法，已經發(fā)展出多種檢測神經毒劑的方法[10，12-14].這些方法具有靈敏度高、操作簡單、可移植性好等優(yōu)點[11].迄今為止報道的用于檢測有機磷神經毒劑的熒光探針大多采用了常見的傳感方案[15-17]，探針的響應主要取決于神經毒劑的親電性，從而導致磷酸鹽酯中間體的形成，將磷酸基通過親核反應轉移到含氮（N）或氧（0）的基團上，如羥基、氨基、肟基、羰基等，能調節(jié)光誘導電子轉移（PET）、內電荷轉移（ICT）[18]、熒光共振能量轉移等能量/電子/電荷轉移過程[4，15，19-20]，最后，這些探針可以被不同波段的光激發(fā)表現出不同的熒光信號，從而實現對神經毒劑的檢測.在各種熒光基團中，萘酰亞胺熒光團顯示出明顯的優(yōu)勢，例如，高發(fā)光量子產率、強烈的熒光發(fā)射，以及易于支架修飾等特點[21-23].本文作者通過萘酰亞胺為母體和水合肼反應形成探針PND，用于快速、靈敏地檢測神經毒劑模擬物.

1實驗部分

1.1 儀器和試劑

主要儀器：核磁共振儀（400 MHz），DRX-400，Bruker;紫外一可見光分光光度計，UV-3900，Hitachi;熒光光譜儀，F-7000，Hitachi.

主要試劑：二氯甲烷（泰坦科技），無水乙純（泰坦科技），石油醚（泰坦科技），乙酸乙酯（泰坦科技），甲醇（泰坦科技），柱層析硅膠（200～300目，黃海），乙腈（安耐吉），N，N-=異丙基乙胺（分析純AR，麥克林），乙二醇單甲醚（分析純AR，麥克林），DCP，氰基磷酸二乙酯（DCNP），水合肼（質量分數為80%，安耐吉），N，N-二甲基甲酰胺（安耐吉），4-溴一l，8一萘二甲酸酐（安耐吉）.

1.2實驗合成

1.2.1化合物2的合成[24]

如圖3所示，首先將4-溴一l，8一萘二酸酐（831 mg，2.9 mmol）和正丁胺（279 mg，3 mmol）放入50 mL的燒瓶中，加入10 mL無水乙醇溶解，}昆合物加熱回流5 h.反應完全后，通過旋轉蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，經柱層析（V（石油醚）/v（二氯甲烷）=1：2）純化粗殘渣，得到純凈的化合物2為淡黃色固體（877 mg，74%產率）.lH NMR（ 400 MHz， CDCl3 ）8， 8.57（ dd ，J=7.3， 1.2 Hz， 1H）， 8.47（ dd，J=8.5， 1.1 Hz， 1H）， 8.33 （d，J=7.8Hz， 1H）， 7.95 （d， J=7.9 Hz， 1H）， 7.76（ dd， J=8.5， 7.3 Hz， 1H）， 4.15—4.02（ m， 2H）， 1.70—1.58（ m， 2H）， 1.43～1.30（ m， 2H）， 0.90 （t， J=7.4 Hz， 3H）.13C NMR（ 100 MHz， CDCl3）8，163.52， 133.08， 13 1.91， 131.10， 13 1.02，13 0.53， 130.08， 128.90， 12 8.00， 123.12， 122.26，40.36， 30.16， 20.36， 13.82.

1.2.2 化合物PND的合成[25]

如圖3所示，稱取1.0 g化合物2加入到燒瓶中，用10 mL乙二醇單甲醚溶解后120℃回流，直到溶液變得澄清，之后向燒瓶中緩慢滴加1 mL，80%（質量分數）的水合肼攪拌10 min，在氮氣（N2）保護的條件下回流4h，TLC點板監(jiān)控反應，反應完全冷卻至室溫后，晶體過濾分離，用乙醇洗滌多次后，得到淡黃色固體PND 0.81 g，產率為94%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ，9.12（s，1H），8.89～8.16（m，3H），7.63（t，J=8.0 Hz， 1H）， 7.24 （d， J=8.6 Hz， 1H）， 4.67 （s， 2H）， 4.25～3.87 （m， 2H）， 1.82～1.49 （m， 2H）， 1.45～1.16 （m，2H） ，0.92（t，J=7.3 Hz，3H）.

2熒光探針的性能測試

2.1 PND反應體系隨時間變化的測試

l cm的石英比色皿中加入2 mL PND溶液（10uL，10 umol·L-1），隨后加入DCP或DCNP（20 uL，20 umol·L-1），混合均勻后，在DMF中測試探針PND隨反應時間的光譜變化.

2.2 PND反應體系的濃度滴定實驗

l cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 uL，10 umol·L-l），隨后逐漸滴加DCP或DCNP（2 uL，2 umol·L-1），混合均勻后，在DMF中測試體系的光譜變化，滴加到體系熒光強度不再變化為止.

2.3 PND對不同神經毒劑模擬物的選擇性實驗

l cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 uL，10 umol ·L-1），隨后分別加入3種不同種類的神經毒劑模擬物：甲基膦酸二甲酯（DMMP）、磷酸三乙酯（TEP）和磷酸三丁酯（HBT）（20 uL，20umol·L-1），混合均與后，在DMF中測試PND對不同神經模擬物的熒光強度變化.

3結果與討論

3.1 PND反應體系隨反應時間的光譜變化

由于DCP和DCNP容易水解，選定DMF作為測試體系，為了確定PND與毒劑模擬物DCP和DCNP的反應時間，首先測定了PND對DCP的響應時間曲線，如圖4所示，探針PND（10 uL）在體系中，在420 nm出現了特征吸收峰，在加入20 umol的DCP之后，溶液的紫外吸收光譜發(fā)生了藍移，圖4（a）所示，在380 nm處出現了新的吸收峰，在395 nm處有一個等吸收點，這可能是因為連接萘酰亞胺的N上的孤對電子被磷束縛，由于誘導反應從而降低了N的給電子能力，導致了吸收的藍移.同時，如圖4（b）所示，探針PND初始熒光信號很弱，在加入DCP后，體系的熒光強度逐漸增強，最終熒光強度穩(wěn)定不變，通由圖4（b）的插圖可以看出，加入DCP 5 min后熒光強度趨于穩(wěn)定，這表明DCP與PND基本反應完全，由于DCP和DCNP有著類似的化學性質，在相同條件下也能表現出非常相似的光譜變化.DCP和DCNP都可以使探針PND的熒光強度增強，這可能是由于肼基與磷酸二乙酯的結合導致探針母體的PET過程受阻，其反應機制如圖5所示，

3.2 PND反應體系的濃度滴定實驗

對PND反應體系進行了濃度滴定實驗，如圖6所示，在沒有DCP的情況下，幾乎沒有觀察到PND在DMF中的熒光強度，當加入0.2當量（即2uL，2umol·L-1）DCP時，探針的紫外光譜強度明顯降低和藍移，如圖6（a）所示.而在520 nm處的熒光迅速增強，如圖6（b）所示，隨著DCP的逐步滴加，熒光發(fā)射強度逐漸增加，當DCP物質的量濃度達到20 umol·L-1時，熒光強度達到最大且穩(wěn)定不變.此外，從圖6（a），6（b）的插圖可以看出熒光和紫外展現出相似的結果，與自由探針PND相比，探針復合DCP后的熒光強度增強了100倍，這些變化可歸因于磷酰胺阻斷了孤對電子的給電子能力，進而導致PET關閉，使熒光增強.圖6（c），6（d）為PND對DCNP物質的量濃度滴定的紫外光譜和熒光光譜圖，由于DCNP和DCP有著類似的性質，所測得的光譜幾乎一致.另外，如圖7所示，在DMF測試體系中，探針PND隨DCP濃度增大，熒光信號逐漸增強，

3.3 PND對不同毒劑模擬物的選擇性實驗

為了進一步確定探針PND的選擇性，采用了3種有機磷化合物DMMP，TEP和HBT作為潛在的干擾物，如圖8所示.當存在DCP和DCNP時，PND在520 nm處產生熒光的明顯增強，并且其他干擾物的溶液熒光沒有明顯變化.由此可見，探針PND對毒劑模擬物DCP和DCNP有很好的選擇性.

4結論

本文設計并合成了基于萘酰亞胺的熒光傳感器，用于神經毒劑模擬物DCP和DCNP的檢測，隨著DCP或DCNP的加入，體系的熒光明顯增強（開關響應），另外探針PND對其他模擬物無明顯響應.因此，PND對神經毒劑的檢測具有很高的靈敏度和選擇性.從基礎科學的角度來看，PND作為神經毒劑探針具有多種優(yōu)點，例如涉及簡單的合成程序和實時檢測，并且可以提供顏色和熒光變化，以幫助實現更好的選擇性模式，總之，本文作者開發(fā)了一種熒光增強型探針PND，可以高選擇性檢測神經毒劑模擬物DCP和DCNP，具有一定的應用價值.

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