山丹丹開放式組織培養(yǎng)抑菌劑的篩選

王凱　蔡曉妮　王延峰

摘要 為簡化組培環(huán)節(jié)，降低組培成本，對開放式組織培養(yǎng)中山丹丹增殖和生根培養(yǎng)基添加次氯酸鈉濃度進行篩選。結(jié)果顯示：添加次氯酸鈉濃度為0.013%時，山丹丹增殖系數(shù)最高;次氯酸鈉濃度為0.016%時，山丹丹生根率最高。最終選擇0.014%為山丹丹開放式組織培養(yǎng)的最適濃度。

關鍵詞 開放式組織培養(yǎng);山丹丹;抑菌劑

中圖分類號 Q 943.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0140-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.034

Selection of Bacteriostatic Agent in Open Tissue Culture of Lilium pumilum

WANG Kai1，2，CAI Xiao-ni3， WANG Yan-feng1，2

（1.College of Life Science， Yanan University， Yanan， Shaanxi 716000;2.Key Laboratory of Chinese Jujube， Yanan， Shaanxi 716000;3.Yanan Zhengda Hong Landscaping Co.， Ltd.， Yanan， Shaanxi 716000）

Abstract In this experiment， the concentration of antibacterial agent （sodium hypochlorite） was selected for the culture medium of proliferation and rooting in open tissue culture of Lilium pumilum. The results showed that when the concentration of sodium hypochlorite was 0.013%， the multiplication coefficient was the highest; when the concentration of sodium hypochlorite was 0.016%， the rooting rate was the highest. Finally， 0.014% was selected as the optimal concentration for open tissue culture of L.pumilum.

Key words Open tissue culture;Lilium pumilum;Bacteriostatic agent

開放式組織培養(yǎng)主要通過添加抑菌劑，擺脫無菌操作環(huán)節(jié)，在未消毒的自然試驗條件中實現(xiàn)的組織培養(yǎng)方式[1]。與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)不同之處在于，開放式組織培養(yǎng)是在開放未消毒的環(huán)境中進行試驗操作，省去高壓鍋和超凈工作臺等設備，簡化組織培養(yǎng)步驟，提高試驗效率，降低組培成本。開放式組織培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基不通過高壓滅菌操作，激素和營養(yǎng)元素損失較少，組培苗品質(zhì)優(yōu)良，通過添加抑菌劑實現(xiàn)開放式組織培養(yǎng)的植物有東北紅豆杉[2]、香蕉[3]、魔芋[4]等。

山丹丹（Lilium pumilum DC.）為百合科百合屬多年生草本植物[5]，其葉狹長，色彩鮮紅，具有觀賞價值，是陜北地區(qū)極其珍貴的城市園林綠化植物[6-7]，山丹丹同時具有一定的食用和藥用價值[8-9]。

篩選次氯酸鈉抑菌劑的合適濃度，進行山丹丹開放式組織培養(yǎng)研究，以期降低組培成本，簡化組培環(huán)節(jié)，增加經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 山丹丹開放式組培的初步建立

1.1.1 材料與培養(yǎng)條件。

1.1.1.1 材料。選用山丹丹種球來源于陜西甘泉（109.34°E、36.27°N），選取外形飽滿、直徑2.5 cm左右、鮮重3.0～3.5 g的健康山丹丹種球。

抑菌劑為次氯酸鈉[10]。

1.1.1.2 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)室采用LED日光燈照明，28 ℃恒溫誘導不定芽萌發(fā)，初期暗處理7 d，不定芽萌發(fā)后采用1 500～2 000 lx光照，光照周期為8：00—20：00（12 h/d）[11]，濕度保持60%～75%。

1.1.2 方法。

1.1.2.1 開放式組織培養(yǎng)培養(yǎng)基配制。MS培養(yǎng)基（蔗糖、瓊脂、 6-BA、 NAA）高壓滅菌后調(diào)pH至5.8～6.0，待瓊脂未凝固前添加一定濃度抑菌劑，分裝封口。

1.1.2.2 外植體的消毒與接種。

純水清洗山丹丹種球，剝?nèi)△[片先用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗5～6次，再用0.1%升汞消毒15 min，無菌水清洗5～6次，最后用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗5～6次[12]。

清洗消毒后切割山丹丹鱗片成1 cm × 1 cm大小，將鱗片內(nèi)側(cè)凹面向上接種培養(yǎng)，每天觀察組織塊污染與分化，統(tǒng)計結(jié)果。

1.1.2.3 抑菌劑的藥效檢驗。

分別添加濃度為0.001%、0.005%、0.01%、0.05%和0.1%的次氯酸鈉進行藥效檢驗。在培養(yǎng)瓶中分別接入4個菌斑（酵母菌和霉菌各2個），每個濃度梯度接5瓶，培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)。觀察抑菌效果，每3 d觀察1次，統(tǒng)計存活率。

存活率=存活菌斑數(shù)/接種菌斑數(shù)×100%

1.2 山丹丹開放式組培的優(yōu)化

1.2.1 材料與培養(yǎng)條件。

以開放式組織培養(yǎng)2代成功誘導且長勢相對一致的分化芽為材料。培養(yǎng)條件同“1.1.1”。培養(yǎng)過程中，及時清理污染的培養(yǎng)瓶。

1.2.2 方法。

1.2.2.1 培養(yǎng)基制備與接種。培養(yǎng)基制備同“1.1.2”。

1.2.2.2 山丹丹增殖培養(yǎng)最佳次氯酸鈉濃度篩選。

將未高溫滅菌操作的MS增殖培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：40 g/L蔗糖、8 g/L瓊脂、1 mg/mL 6-BA、0.1 mg/mL NAA）分為7組，分別加入濃度為0.007%、0.009%、0.011%、0.013%、0.015%、0.017%和0.019%的次氯酸鈉，在自然開放的環(huán)境下，接入“1.1.2”中所得山丹丹鱗片誘導長勢相近的叢生芽，每瓶接入3株叢生芽，每組濃度梯度接10瓶，對照組為傳統(tǒng)組培經(jīng)高溫滅菌處理，組培室光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察30 d后統(tǒng)計污染率和增殖系數(shù)，及時剔除污染組培苗。

污染率=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100%

增殖系數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%

1.2.2.3 山丹丹生根培養(yǎng)最佳次氯酸鈉濃度篩選。

將未高溫滅菌操作的生根培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方：35 mg/L蔗糖、8 mg/L瓊脂和1.0 mg/mL NAA，pH 6.0）分為7組，分別加入濃度為0.006%、0.008%、0.010%、0.012%、0.014%、0.016%和0.018%的次氯酸鈉。待山丹丹幼芽長至約4 cm時，取長勢好、無根的單株幼芽，以開放的形式接入生根培養(yǎng)基，每瓶接入3株幼芽，每組接20瓶，培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，連續(xù)觀察30 d后統(tǒng)計污染率和生根率，及時剔除污染組培苗。

污染率=污染瓶數(shù)/接種瓶數(shù)×100%

生根率=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理 利用 SPSS 16. 0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接菌試驗抑菌劑有效濃度確定

由表1可知，次氯酸鈉對細菌和真菌的抑菌效果明顯，次氯酸鈉濃度為0.05%時，細菌和真菌的存活率為0。

2.2 山丹丹開放式增殖培養(yǎng)次氯酸鈉濃度的優(yōu)化

由表2可知，污染率與次氯酸鈉濃度呈負相關，而增殖系數(shù)隨著次氯酸鈉濃度的增加，出現(xiàn)先升高后降低的趨勢;增殖系數(shù)最高為3.28，此時次氯酸鈉濃度為0.013%，污染率為12.79%;次氯酸鈉濃度在0.009%和0.019%時增殖系數(shù)差異不顯著，當次氯酸鈉濃度高于0.013%后，增殖系數(shù)降低，這是次氯酸鈉濃度越高對山丹丹不定芽毒害作用越大所致。

2.3 山丹丹開放式生根培養(yǎng)次氯酸鈉濃度的優(yōu)化

由表3可知，污染率與次氯酸鈉濃度呈負相關，而生根率隨著次氯酸鈉濃度的增加，出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，生根數(shù)與次氯

酸鈉濃度呈負相關;生根率最高為85.7%，此時次氯酸鈉濃度為0.016%，污染率為11.7%，生根數(shù)為4.48;當次氯酸鈉濃度為0.014%時，與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的生根數(shù)沒有顯著性差異。選擇0.014%為山丹丹增殖和生根培養(yǎng)的最佳抑菌濃度。

2.4 開放式增殖與生根最佳培養(yǎng)基的驗證

由表4、圖1可以看出，開放式組培的污染率（11.45%）高于傳統(tǒng)組培（6.01%）;

3 結(jié)論與討論

該試驗對開放式組培過程中山丹丹增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基次氯酸鈉最佳抑菌濃度進行篩選，結(jié)果可得培養(yǎng)芽的污染率和次氯酸鈉濃度呈正相關，而增殖系數(shù)和生根率隨著次氯酸鈉濃度的增加出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。培養(yǎng)芽的增殖系數(shù)最高時，次氯酸鈉添加濃度為0.013%，此時污染率略高于傳統(tǒng)組織培養(yǎng);當次氯酸鈉濃度為0.016%時，盡管此時的污染率降低，培養(yǎng)芽生長的根數(shù)較多，但增殖系數(shù)降低，是由于次氯酸鈉濃度越高，對山丹丹不定芽毒害作用越大

所致，如再提高抑菌劑濃度，生根數(shù)和根長都會受到抑制。為降低不定芽的污染，兼顧生根和增殖，選擇0.014%為山丹丹開放式組織培養(yǎng)的最適抑菌濃度。

傳統(tǒng)組織培養(yǎng)具有污染率低的優(yōu)點，但其需要嚴格的無菌操作和無菌培養(yǎng)環(huán)境，消毒過程中易造成培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和激素損失，影響后期培養(yǎng)芽的增殖和生長狀態(tài)，同時無菌操作環(huán)節(jié)所需儀器設備等投入增加了生產(chǎn)成本，降低了經(jīng)濟效益。開放式組織培養(yǎng)是組織培養(yǎng)的一種改進形式，這種培養(yǎng)需借助抑菌劑抑制培養(yǎng)環(huán)境中的微生物生長，在開放未消毒的環(huán)境中進行試驗操作，省去無菌操作，簡化組培環(huán)節(jié)，降低了生產(chǎn)成本，激素和營養(yǎng)元素損失較少，組培苗品質(zhì)優(yōu)良。開放式組織培養(yǎng)的關鍵在于抑菌劑的使用，

抑菌劑種類和濃度的選擇關乎開放式組織培養(yǎng)的成敗。該試驗選擇次氯酸鈉作為抑菌劑，篩選合適的使用濃度，為山丹丹的開放式組培奠定了基礎，同時也為開放式組織培養(yǎng)中抑菌劑的使用提供了理論依據(jù)和選擇參考。

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基金項目 國家自然科學基金項目（31751005）;陜西省重點研發(fā)計劃項目 （2018SF-331）;延安市科技局項目（2018CGZH-16）。

作者簡介 王凱（1991—），男，陜西安塞人，碩士，從事生物化學與分子生物學研究。*通信作者，教授，博士，從事植物資源研究與利用、植物功能基因組研究。

收稿日期 2020-03-30;修回日期 2020-05-09