中華鹵蟲(chóng)（Artemia sinica）家系構(gòu)建的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)

張志偉 李龍 羅耀明 戰(zhàn)杰 張曉芳 潘萍萍

摘 要：為研究中華鹵蟲(chóng)（Artemia sinica）家系構(gòu)建過(guò)程中休眠卵收集參數(shù)以及影響其生殖方式的環(huán)境條件，實(shí)驗(yàn)利用中華鹵蟲(chóng)四個(gè)地理品系野生卵在實(shí)驗(yàn)室條件下孵化培養(yǎng)后，通過(guò)品系間和品系內(nèi)的交配繁殖所產(chǎn)生的F1代休眠卵為材料進(jìn)行家系構(gòu)建，一共成功構(gòu)建了188個(gè)家系，其中29個(gè)半同胞家系。對(duì)各家系休眠卵的收集參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，多數(shù)家系在抱對(duì)后96 h內(nèi)便產(chǎn)生后代，但在抱對(duì)145 h后產(chǎn)后代家系數(shù)明顯減少，并以生產(chǎn)2批卵的家系最多，可以生產(chǎn)4批卵以上的家系較少。各家系產(chǎn)后代個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，以產(chǎn)卵量在151～200粒之間的家系最多?！翱扇斯ふ{(diào)控生殖方式”實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，促其營(yíng)卵生的條件是鹽度77‰、餌料21.43 mg/2只。促其營(yíng)卵胎生的條件是鹽度30‰、餌料53.57 mg/2只，因而在家系構(gòu)建時(shí)可以利用“可人工調(diào)控生殖方式”來(lái)促其產(chǎn)生后代，以建立較多數(shù)量的家系來(lái)擴(kuò)大選育種質(zhì)資源，這或許也是解決半同胞家系構(gòu)建困難的一個(gè)策略。

關(guān)鍵詞：中華鹵蟲(chóng)（Artemia sinica）;家系構(gòu)建;關(guān)鍵技術(shù)

中華鹵蟲(chóng)（Artemia sinica）是我國(guó)的一種兩性生殖鹵蟲(chóng)群體，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)（Arthopoda），有腮亞門(mén)（Branchiata），甲殼綱（Crustacea），腮足亞綱（Branchiopoda），無(wú)甲目（Anostraca），鹵蟲(chóng)科（Artemiidae），鹵蟲(chóng)屬（Artemia），在北方，鹵蟲(chóng)群體有山西運(yùn)城群體、內(nèi)蒙古阿拉善左旗群體、內(nèi)蒙古伊克昭盟群體等。鹵蟲(chóng)是一種耐高鹽度的世界性分布的小型甲殼動(dòng)物[1]，種質(zhì)資源十分廣泛。鹵蟲(chóng)個(gè)體小，繁殖周期短，約2～3個(gè)月，易于操作和配種，生殖方式有卵生和卵胎生兩種[2]，在控制環(huán)境條件下可以對(duì)其生殖方式進(jìn)行人工調(diào)控，適合作為構(gòu)建水產(chǎn)動(dòng)物多世代遺傳評(píng)定的模式生物。因此，本文探索了家系后代收集的基本參數(shù)及影響鹵蟲(chóng)產(chǎn)生休眠卵和產(chǎn)生幼體的鹽度、餌料條件，最終達(dá)到“可人工調(diào)控其生殖方式”的目的。例如：調(diào)控產(chǎn)卵條件，可以獲取充足的家系種質(zhì)備份，方便遺傳進(jìn)展和多樣性的對(duì)比分析。而調(diào)控產(chǎn)幼體條件，可以縮短中華鹵蟲(chóng)家系選育周期，這樣便能在短時(shí)間內(nèi)建立多世代繁殖群體。

家系構(gòu)建是對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物性狀進(jìn)行遺傳評(píng)估的重要手段[3]。家系指由共同親本繁衍下來(lái)的若干世代。家系選擇（family selection）是指以家系為單位，以各家系受選擇性狀的平均值為標(biāo)準(zhǔn)所進(jìn)行的選擇育種[4]。構(gòu)建家系開(kāi)展遺傳選育憑其周期短、操作簡(jiǎn)便、效果好、可抑制遺傳衰退、是分子育種的基礎(chǔ)等優(yōu)點(diǎn)已成為海水養(yǎng)殖良種培育體系的主體力量[5]，而有關(guān)中華鹵蟲(chóng)家系構(gòu)建的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)就中華鹵蟲(chóng)家系構(gòu)建過(guò)程中家系后代收集參數(shù)以及影響其生殖方式的環(huán)境條件進(jìn)行了研究，以期為中華鹵蟲(chóng)的家系選育提供重要的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

所用材料為中華鹵蟲(chóng)（Artemia sinica）四個(gè)地理品系野生卵在實(shí)驗(yàn)室條件下孵化培養(yǎng)后，通過(guò)品系間和品系內(nèi)交配繁殖所產(chǎn)生的F1代休眠卵。各品系的產(chǎn)地和代碼等信息見(jiàn)表1。其中的SIN品系和YIM品系由比利時(shí)國(guó)際鹵蟲(chóng)參考中心的G. Van Stappen 博士和P. Sorgeloos博士提供，ALXZ品系、BDJL品系由中國(guó)海洋大學(xué)孫世春博士提供。

1.2 孵化與培養(yǎng)條件

2018年11月24日開(kāi)始孵化F1代休眠卵，在400 L光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，孵化條件為溫度26 ℃、鹽度30‰、全天光照（光照強(qiáng)度3 000 lx），孵化時(shí)間36 h。隨機(jī)選取在相同時(shí)間孵出的鹵蟲(chóng)幼體50只到500 mL的燒杯中按1個(gè)/10 mL標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行暫養(yǎng)10 d。培養(yǎng)溫度為25 ℃，鹽度為77‰，全天光照（3 000 lx），每3 d換水一次。餌料為鹽生杜氏藻（Dunaliella salina），培養(yǎng)溫度為25 ℃，鹽度為77 ‰（鹽度調(diào)節(jié)采用向自然海水中加NaCl的方法），光照大約為3 000 lx，光照周期為12 h黑暗/12 h光照[6]。

養(yǎng)殖到第10日齡時(shí)，把每個(gè)個(gè)體單獨(dú)轉(zhuǎn)移至50 mL透明塑料小瓶中按1個(gè)/35 mL標(biāo)準(zhǔn)單獨(dú)養(yǎng)殖，并對(duì)小瓶進(jìn)行單獨(dú)編號(hào)，以實(shí)現(xiàn)各性狀值與個(gè)體準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)，同時(shí)避免了因家系內(nèi)雌雄個(gè)體抱對(duì)和雄性個(gè)體相互抱持在一塊而降低有效個(gè)體數(shù)量。

1.3 家系構(gòu)建

將個(gè)體養(yǎng)殖至第20日齡時(shí)，測(cè)定其個(gè)體水平上的體長(zhǎng)、體重性狀值。在解剖鏡下利用目微尺測(cè)量體長(zhǎng)。通過(guò)精確度為萬(wàn)分之一的電子天平測(cè)定體重，并記錄測(cè)量日期、時(shí)間，個(gè)體所處的養(yǎng)殖環(huán)境信息，以便對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行更加準(zhǔn)確的校正。同時(shí)，每個(gè)家系設(shè)置多個(gè)重復(fù)以降低因環(huán)境差異而對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成的影響。

根據(jù)測(cè)得性狀值利用Asreml軟件計(jì)算個(gè)體選擇指數(shù)并選擇留種個(gè)體，2018年12月29日開(kāi)始建立家系，方法是將選擇指數(shù)大于97且相互之間沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體按照選擇指數(shù)高低依次進(jìn)行配對(duì)，將1雌1雄配對(duì)后單獨(dú)培養(yǎng)于50 mL透明塑料小瓶。每天檢查各家系產(chǎn)后代情況，及時(shí)分離產(chǎn)出的后代。2019年1月28日實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共計(jì)63 d。

1.4 生殖方式的環(huán)境調(diào)控

隨機(jī)選取規(guī)格相當(dāng)?shù)拇菩蹅€(gè)體，按照一雌一雄配對(duì)置于50 mL醫(yī)用小瓶中進(jìn)行養(yǎng)殖管理。養(yǎng)殖期間直至交配產(chǎn)生后代均按35 mL水體/2只進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖，并記錄各家系產(chǎn)后代情況。餌料為澳帝力精純螺旋藻片。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)鹽度條件：分別為30‰、60‰、77‰，2個(gè)餌料條件（一個(gè)餌料富足條件、一個(gè)餌料缺乏條件），根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將餌料投喂標(biāo)準(zhǔn)定為每天投餌一次，投餌量為21.43 mg /2只、5357 mg /2只。一共設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，A1組：鹽度30‰，投餌量為21.43 mg /2只，A2組：鹽度30‰，投餌量為53.57 mg /2只。B1組：鹽度60‰，投餌量為21.43 mg /2只，B2組：鹽度60‰，投餌量為53.57 mg /2只。C1組：鹽度77‰，投餌量為21.43 mg /2只，C2組：鹽度77‰，投餌量為53.57 mg /2只，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)30個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，同時(shí)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下設(shè)置一個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 20日齡鹵蟲(chóng)體長(zhǎng)、體重性狀值描述統(tǒng)計(jì)

中華鹵蟲(chóng)第20日齡體長(zhǎng)值、體重值分別介于5 690.60～13 634.40 μm、3.5～41.0 mg之間。體長(zhǎng)、體重變異系數(shù)差別較大，分別為18.79%、52.74%，表明體重較體長(zhǎng)有較大的選育空間。

2.2 各家系最早抱對(duì)與最早產(chǎn)后代時(shí)間間隔

本文共成功建立了188個(gè)家系。各家系最早抱對(duì)與最早產(chǎn)后代時(shí)間間隔見(jiàn)圖1，結(jié)果表明多數(shù)家系在抱對(duì)后96 h內(nèi)便產(chǎn)生后代，產(chǎn)后代高峰出現(xiàn)在抱對(duì)后72～96 h，其次為抱對(duì)后1～24 h。另外，抱對(duì)后121～144 h產(chǎn)后代家系數(shù)量也較多，但在抱對(duì)145 h后產(chǎn)后代家系數(shù)明顯減少。

2.3 各家系產(chǎn)卵批次及產(chǎn)后代數(shù)量統(tǒng)計(jì)

各家系產(chǎn)卵批次統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（圖2），以生產(chǎn)2批卵的家系最多，其次為生產(chǎn)1批卵和生產(chǎn)3批卵的家系，但可以生產(chǎn)4批卵以上的家系較少。各家系產(chǎn)后代個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖3，前4個(gè)產(chǎn)卵數(shù)量段分布的家系數(shù)均超過(guò)25個(gè)，以產(chǎn)卵量在151～200粒之間的家系最多，但仍有34個(gè)家系的產(chǎn)卵總量在10～50粒，并且有32個(gè)家系產(chǎn)生幼體。2.4 生殖方式的環(huán)境調(diào)控

圖4結(jié)果表明，產(chǎn)卵方面，C1、C2組條件下產(chǎn)卵家系數(shù)均大于B1、B2、A1、A2組，并以C1組產(chǎn)卵家系數(shù)最多。產(chǎn)幼體方面，低鹽度條件能明顯促進(jìn)鹵蟲(chóng)產(chǎn)幼體。而且在53.57 mg/2只的餌料條件下產(chǎn)幼體家系比例有較大提高，如A2、B2、C2組。

3 討論

3.1 大規(guī)模家系構(gòu)建的成功豐富了育種種質(zhì)資源

建立家系進(jìn)行良種選育已在蝦、魚(yú)類(lèi)中取得顯著成績(jī)。張?zhí)鞎r(shí)等[7]利用人工授精技術(shù)成功建立了101個(gè)中國(guó)對(duì)蝦家系，其中半同胞家系29個(gè)，為以后的選擇育種研究和家系選育打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。楊國(guó)梁等[8]利用羅氏沼蝦3個(gè)群體，通過(guò)巢式交配設(shè)計(jì)成功建立了123個(gè)家系，其中半同胞家系37個(gè)。張建森等[9]利用大規(guī)模建鯉育種基礎(chǔ)群（千萬(wàn)尾）選育繁育群體（2 000～2 500尾）按雄雌比1∶2建立家系，對(duì)建鯉進(jìn)行了3代選育和生產(chǎn)驗(yàn)證，結(jié)果表明比選育前建鯉群體增重快13.6%～15.1%。伴隨選擇育種技術(shù)的迅猛發(fā)展以及無(wú)序的養(yǎng)殖生產(chǎn)，不可避免地產(chǎn)生一些消極影響，譬如，病害頻發(fā)、個(gè)體小型化[10]、遺傳多樣性下降、近交衰退，究其最終原因是種質(zhì)資源匱乏即有效群體數(shù)較小[11]，因此，擴(kuò)大選育群體、增加有效群體數(shù)量便迫在眉睫。通過(guò)大規(guī)模家系構(gòu)建來(lái)豐富種質(zhì)資源儲(chǔ)備不失為解決這一問(wèn)題直接有效的方法。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了188個(gè)家系，其中29個(gè)半同胞家系，為中華鹵蟲(chóng)家系選育提供了豐富的種質(zhì)資源，并對(duì)各家系休眠卵的收集參數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明多數(shù)家系在抱對(duì)后96 h內(nèi)便產(chǎn)生后代，產(chǎn)后代高峰出現(xiàn)在抱對(duì)后72～96 h，而在抱對(duì)145 h后產(chǎn)后代家系數(shù)明顯減少。并以生產(chǎn)2批卵的家系最多，但可以生產(chǎn)4批卵以上的家系較少。這與周可新等[12]的研究結(jié)果一致。各家系產(chǎn)后代個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，前4個(gè)產(chǎn)卵數(shù)量段分布的家系數(shù)均超過(guò)25個(gè)，以產(chǎn)卵量在151～200粒之間的家系最多，但有32個(gè)家系產(chǎn)生幼體即營(yíng)卵胎生。這些參數(shù)的獲得可以指引中華鹵蟲(chóng)大規(guī)模家系構(gòu)建有的放矢，為家系選育打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

3.2 半同胞家系構(gòu)建存在的難點(diǎn)及可行的解決方案

本實(shí)驗(yàn)成功建立了29個(gè)半同胞家系，占家系總數(shù)比例較上述報(bào)道偏低，原因之一是受雄性個(gè)體生殖活力限制，半同胞家系建立方法是先將雄性個(gè)體與一個(gè)雌性個(gè)體交配，待交配產(chǎn)卵結(jié)束雌雄個(gè)體自動(dòng)分開(kāi)后再將該雄性個(gè)體與另一個(gè)雌性個(gè)體交配建立家系，這樣使得雄性個(gè)體在與第一個(gè)雌性個(gè)體交配時(shí)消耗了大量的精子而造成了與第二個(gè)雌體的交配困難，同時(shí)，又因鹵蟲(chóng)個(gè)體較小而無(wú)法將精子取出后直接注入到雌性個(gè)體的卵囊中，這樣就直接導(dǎo)致了中華鹵蟲(chóng)半同胞家系構(gòu)建的困難。原因之二是沒(méi)有找到合適的環(huán)境條件來(lái)誘導(dǎo)其產(chǎn)生后代。黃成等[13]研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)大鹽湖鹵蟲(chóng)（Artemia francisana）和東營(yíng)鹵蟲(chóng)（Artemia sinina）產(chǎn)休眠卵的最佳條件分別是鹽度90‰、溫度10 ℃或者15 ℃，鹽度90‰、溫度15 ℃，而有關(guān)本實(shí)驗(yàn)所用中華鹵蟲(chóng)四群體尤其是在餌料條件上誘導(dǎo)后代產(chǎn)生的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

基于上述情況，本實(shí)驗(yàn)對(duì)中華鹵蟲(chóng)的“可人工調(diào)控生殖方式”在鹽度、餌料水平上進(jìn)行了研究，結(jié)果表明產(chǎn)卵方面，C組條件下產(chǎn)卵家系數(shù)均大于B組、A組條件，并以21.43 mg/2只的餌料條件產(chǎn)卵家系數(shù)最多。產(chǎn)幼體方面，低鹽度條件能明顯促進(jìn)鹵蟲(chóng)產(chǎn)幼體。而且在53.57 mg/2只的餌料條件下產(chǎn)幼體家系比例有較大提高。因此，促其營(yíng)卵生的條件是鹽度77‰、餌料21.43 mg/2只。促其營(yíng)卵胎生的條件是鹽度30‰、餌料5357 mg/2只，進(jìn)而在家系構(gòu)建時(shí)可以利用“可人工調(diào)控生殖方式”來(lái)促其產(chǎn)生后代，以建立較多數(shù)量的家系來(lái)擴(kuò)大選育種質(zhì)資源，這或許也是解決半同胞家系構(gòu)建困難的一個(gè)有效策略。

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Several key techniques in family construction of Artemia sinica

ZHANG Zhiwei1， LI Long1， LUO Yaoming2， ZHAN Jie1， ZHANG Xiaofang1， PAN Pingping1

（1. Shandong Oriental Ocean Sci-Tech Co.，Ltd. Yantai 264003， China;2.Dalian Modern Agricultural Production Development Service Center，Dalian 116023，China）

Abstract：Several key techniques in family construction of A.sinica were studied. The artemia? in this experiment was the F1 offspring of the 4 domestic populations by using self- and hybrid-mating.188 full-sib families，29 sub-sib families were obtained. The quantitative statistics of collecting offspring for each family showed that the first batch of offspring being produced in 96 h ，in most families， after the clasping phenomenon being observed for the first time， but there was a linearly decrease of offspring produced after 145 h. The total offspring number ranged from 151 to 200 with 2 batches produced in most of the families. The “artificial control mode of reproduction” experiment gave us a result that the reproduction mode could be controlled with the salinity 77‰ and food 21.43 mg/2samples for producing cysts（C1）， while with the salinity 30‰ and food 53.57 mg/2samples for producing larvae（A2）， respectively. Therefore， this mode can be used to construct a large amount of families， and it might be a method for sub-sib families construction.

Key words：Artemia sinica; family construction;key techniques

（收稿日期：2020-10-27;修回日期：2020-11-12）