‘興義矮腳雞’與‘貴州矮腳黃雞’雜交試驗

葉濤,吳古榮，李輝,王姣，羅韋，楊金春

(1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；4.貴州省興義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 興義 562400)

我國地方品種雞分布區(qū)域廣泛,同一省份地方雞種繁多[1].貴州‘興義矮腳雞’因其產(chǎn)于貴州省黔西南州興義市及周邊地區(qū)，體型矮小，脛長短小而得名[2].‘興義矮腳雞’屬于兼用型品種，體軀勻稱，體質(zhì)結(jié)實，脛短，體呈匍匐狀，羽色分黃羽、麻羽、黑羽3種，單冠，肉嫩味鮮，適應(yīng)性強.1993年被收錄于《貴州省畜禽品種志》，2006年被列入《國家畜禽遺傳資源保護名錄》，2011年被收錄于《中國畜禽遺傳資源志》[3].

家禽的Cp(creeper)基因是由Landauer 和Dunn[4]命名的，他們通過雜交試驗，發(fā)現(xiàn)了一種軟骨發(fā)育不正常的矮小的匍匐型雞，這種雞的匍匐性狀是由常染色體上顯性純合致死基因Cp控制，這是一個引起軟骨不正常發(fā)育的半致死基因，顯性純合子(Cp/Cp)表現(xiàn)為致死型，在孵化的過程中將全部死亡，雜合子(Cp/+)表現(xiàn)為匍匐型，隱性純合子(+/+)表現(xiàn)為野生型.曹娟等[5]的研究證實了‘興義矮腳雞’的矮腳性狀就是Cp基因?qū)е碌?金四華[6]進一步的研究表明Cp基因決定‘興義矮腳雞’矮腳性狀的遺傳機理是由7號染色體上印度刺猬因子[7](Indianhedgehog，IHH)基因的缺失所引起.IHH主要與骨骼的發(fā)育有關(guān)，參與調(diào)節(jié)軟骨的分化[8].

1935年蘇聯(lián)學(xué)者Behtank就發(fā)現(xiàn)了dw基因.對dw基因進行進一步的研究之后發(fā)現(xiàn)，dw和DW是不完全隱性等位基因[9].dw基因位于雞Z染色體，屬于伴性遺傳，正常基因DW對dw顯性，只有dw純合子的公雞和攜帶dw基因的母雞才表現(xiàn)矮小性狀[10].dw基因并不是直接影響雞的生長生理，而是通過調(diào)控其他的基因的表達，從而影響雞體內(nèi)有關(guān)激素分泌和相關(guān)酶的形成，雞的生長性能就會受到很大的影響.Leung等[11]的研究推測出GHR基因缺失或GHR數(shù)量減少是使雞產(chǎn)生矮小性狀的主要原因.Burnside[12]等進行進一步的研究發(fā)現(xiàn)，GHR基因上的一個突變可能是矮小雞特殊表型的原因.dw基因是影響矮腳性狀的基因中唯一對雞本身健康無害的隱性、伴性突變基因[13].在雞的飼養(yǎng)中，dw基因會使飼料消耗量減少20%左右，提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能，降低畸形蛋和軟殼蛋的發(fā)生率，減少破蛋率[14].如貴州大學(xué)選育的dw基因控制的‘矮腳黃雞’，由于脛短而導(dǎo)致身矮，性情溫馴而且耗料少,，是籠養(yǎng)或規(guī)?；B(yǎng)殖的特選雞種[15].

正因為Cp基因純合子在孵化期全部致死，因此后代所觀察到的矮腳雞只能是雜合子，不能穩(wěn)定遺傳，后代出現(xiàn)矮腳、高腳的分離現(xiàn)象，直接影響到經(jīng)濟效益，所以在‘興義矮腳雞’產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中需要通過品種改良來解決這一問題.本研究引入‘貴州矮腳黃雞’對‘興義矮腳雞’進行雜交，采用標記輔助選育，經(jīng)過2代雜交用dw基因代替興義矮腳雞的Cp基因，以期保留矮腳性狀的同時解決矮腳性狀不能穩(wěn)定遺傳的生產(chǎn)問題,這是一次新的育種嘗試.本研究檢測了‘興義矮腳雞’和雜交F1代的Cp基因和dw基因，測定并分析了雜交F1代及其親本的不同日齡的脛長，為F1代自交提供選種依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 該試驗以‘興義矮腳雞’‘貴州矮腳黃雞’‘興義矮腳雞’雜交F1代雞作為研究對象，其中‘貴州矮腳黃雞’由貴州大學(xué)種雞場選育提供，‘興義矮腳雞’由興義鴻鑫農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責任公司種雞場選育提供.試驗動物的孵化、飼養(yǎng)、脛長實驗數(shù)據(jù)測量和樣品采集在興義鴻鑫農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責任公司種雞場進行，試驗動物的飼養(yǎng)條件保持一致.

隨機對30只‘興義矮腳雞’和107只‘興義矮腳雞’雜交F1代分別進行血樣采集，肝素鈉抗凝管放置于冰盒暫時保存，運回實驗室以后改用冰箱-20 ℃保存.

1.2 試驗方法

1.2.1 脛長測定 分別測定‘興義矮腳雞’‘矮腳黃雞’和興黃雜一代雞各雞群0、2、4、6、8、10、12、14、18、20周齡脛長.

1.2.2 雞血液基因組DNA的提取 本試驗使用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根)，對雞血液樣品進行基因組DNA的提取，使用微量紫外分光光度計檢測濃度和純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 引物設(shè)計與合成dw基因的擴增使用的2對引物參照冒世杰等[16]的研究，序列分別為F1F:5′-TCCCAGACTACACTTCTATTCA-3′;F1R:5′-CGGGGACAGATCAAAGACAATAC-3′;F2F:5′-ACCTCCAAAGAAATCTGTCGAG-3′;F2R:5′-TGGCCAAATCCTGAAGTCCT-3′，Cp基因PCR引物序列參照金四華[6]的研究，序列見下表，以上引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成.

表1 PCR引物序列

1.2.4 PCR擴增dw基因的PCR擴增反應(yīng)體系采用20 μL體系，1 μL DNA,引物F1F、F1R、F2F、F2R分別為1 μL,PCR Master MIX(2×)為10 μL,5 μL dd H2O.聚合酶鏈式反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)，72 ℃終止延伸10 min，4 ℃保存.

Cp基因進行PCR擴增所采用的體系為15 μL，其中DNA1 μL，兩對引物各2 μL，,PCR Master MIX(2×)為6 μL，用ddH2O補足15 μL.聚合酶鏈式反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃終止延伸5 min，4 ℃保存.

擴增反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，或直接用?%TBE凝膠電泳實驗來鑒定基因型.

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究采用SPSS 18.0軟件，區(qū)分公母雞，對‘興義矮腳雞’‘貴州矮腳黃雞’和雜交F1雞群不同周齡的脛長數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan法進行多重比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 dw基因的鑒定

將擴增所得的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成相系統(tǒng)觀察DNA條帶.結(jié)果顯示：顯性純合型雞的基因型為ZDWZDW或者ZDWW,只擴增出1條417 bp的條帶，雜合型的檢測雞的基因型為ZDWZdw,擴增出1條217 bp的條帶和一條417 bp的條帶，隱性純合型檢測雞的基因型為ZdwZdw或者ZdwW,只擴增出1條217 bp的條帶(圖1).根據(jù)性別結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，判斷107只雜交雞個體的基因型，計算群體的基因型頻率，結(jié)果見表2.

圖1 基因型的鑒定結(jié)果Figure 1 Identification results of genotypes

2.2 Cp基因的鑒定

‘興義矮腳雞’雜交F1代的Cp基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳(圖2).

圖2 雜交F1代PCR擴增結(jié)果Figure 2 PCR amplification results of F1generation hybrid

表2 雜交F1代雞dw基因遺傳特性

由上圖結(jié)果顯示：雜交F1代PCR擴增產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測中也只產(chǎn)生2種類型的條帶，其中只有438 bp的條帶個體的基因型為(+/+)高腳型，同時得出438 bp和224 bp 2條條帶的基因型為(Cp/+)雜合子型.

通過凝膠電泳成像，分析2種雞所含的基因，判斷在雜交F1代中是否將致死基因Cp剔除，并計算出各種雞所含基因型的基因型頻率，其結(jié)果統(tǒng)計如表3所示，結(jié)合以上dw基因與Cp基因的鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在107只雜交F1代雞中，既含有dw基因又不含Cp基因的個體數(shù)為19只.

2.3 脛長結(jié)果與分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件根據(jù)不同類型雞在不同周齡測得的脛長數(shù)據(jù)，區(qū)分公母進行單因素方差分析，Duncan法多重比較，結(jié)果如表4所示.雜交F1代雞初生時的脛長與‘興義矮腳雞’對比差異顯著，同‘貴州‘矮腳黃雞’’對比差異極顯著，在6周齡以前，‘貴州‘矮腳黃雞’’脛長都長于‘興義矮腳雞’，雜交F1代雞的脛長位于兩者之間.各品種中公雞的脛長在0～20周齡都大于母雞的脛長.公雞的脛長除了在10周齡時，雜交F1代雞與其它兩者差異極顯著，在其它周齡差異都不顯著，0～20周齡，雜交F1代母雞與‘興義矮腳雞’母雞差異都不顯著.12周齡以后，雜交F1代公雞和‘興義矮腳雞’公雞之間，以及雜交F1代母雞和‘興義矮腳雞’母雞之間的脛長對比都差異不顯著.

表3 兩種雞的三種基因型頻率統(tǒng)計結(jié)果

表4 不同周齡雞脛長分析

3 討論

本試驗選擇的‘貴州‘矮腳黃雞’’屬仿土雞類型優(yōu)質(zhì)雞,培育水平較高,生長速度快.而‘興義矮腳雞’是地方品種,培育水平相對不高，生長速度相對較慢[17].而且陳明等[18]與朱遠春等[19]的研究結(jié)果一致表明‘矮腳黃雞’的屠宰率和胸腿肌率都比‘興義矮腳雞’高,說明‘矮腳黃雞’的產(chǎn)肉性能相對更好.利用‘矮腳黃雞’中所含的dw基因代替Cp基因來保留‘興義矮腳雞’的矮腳性狀和優(yōu)質(zhì)風味的同時，提高產(chǎn)肉性能，為培育適合市場的品系提供了方向.

因為‘貴州矮腳黃雞’不含Cp基因，所以在雜交一代中：Cp基因的(+/+)基因型頻率和(Cp/+)基因型頻率均為50%，不存在(Cp/Cp)基因個體，符合孟德爾遺傳規(guī)律.本研究在雜交F1代雞中檢測到含有dw基因的雜合個體一共24只，公母各12只，通過引進‘貴州矮腳黃雞’與‘興義矮腳雞’進行雜交，能夠?qū)w基因?qū)腚u群，但數(shù)量較少，有待于擴大樣本進行試驗.這24只含有dw基因的個體中剔除了cp基因的為19只，這19只個體可用于F1代自交，在F2代再使用分子標記進行早期鑒定，即可得到剔除了Cp基因又為dw基因純合的個體，這些個體可穩(wěn)定遺傳矮腳性狀又不存在胚胎期致死，該方法與傳統(tǒng)育種相比可大大的縮短育種進程.

在6周齡以前，‘貴州矮腳黃雞’脛長都長于‘興義矮腳雞’，與查龍應(yīng)等[20]研究結(jié)果一致，而雜交雞的脛長在兩品種之間，這是由于dw基因?qū)γ勯L的影響是在生長過程中才逐漸表現(xiàn)出來的[21]，不同于Cp基因從胚胎時期就開始影響雞個體的發(fā)育.12周齡后‘興義矮腳雞’母雞脛長才超過‘矮腳黃雞’母雞，16周齡后‘興義矮腳雞’公雞的脛長才超過‘矮腳黃雞’公雞，與查龍應(yīng)等[20]的研究結(jié)果在8周齡不同，原因可能與飼養(yǎng)條件的不同有關(guān)，也可能因為本實驗計算的是區(qū)分性別的群體脛長.

4 結(jié)論

本研究首次采用分子標記輔助選育，在雜交F1代雞中挑選出了19只既含有dw基因，又不含有Cp基因的個體，經(jīng)過一代雜交即可剔除Cp基因，傳統(tǒng)選育還需進行測交檢驗，該方法大大提高了育種效率，節(jié)約了育種成本和時間.