新生兒聽力篩查聯(lián)合PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)在遺傳性非綜合征型耳聾患兒篩查中的應(yīng)用

蘇炳森，蘇小杰，成立松，吳柳英

廣東省中山火炬開發(fā)區(qū)醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.產(chǎn)科，廣東中山 528437

耳聾是由聽覺傳導(dǎo)通路發(fā)生器質(zhì)性或功能性病變導(dǎo)致，每年有1/1 000～3/1 000的新生兒為耳聾患兒，耳聾還會(huì)導(dǎo)致語言障礙，對(duì)患兒及其家庭造成嚴(yán)重影響[1]。耳聾患者60%以上為遺傳性耳聾，而60%～70%的遺傳性耳聾為遺傳性非綜合征型耳聾[2-3]。遺傳性非綜合征型耳聾發(fā)病原因?yàn)榛蚪M異常導(dǎo)致聽力功能障礙，但未合并其他系統(tǒng)異常，臨床上以GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因突變最為常見。聽力篩查可早期診斷新生兒耳聾，但篩查未通過的新生兒需要在3個(gè)月后再進(jìn)行聽力診斷，可能導(dǎo)致患兒錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)具有操作簡單、價(jià)格便宜、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是耳聾基因突變檢測(cè)的新方法，可一次性檢測(cè)4個(gè)耳聾基因的9個(gè)突變位點(diǎn)[4]。本文以新生兒作為研究對(duì)象，分析自動(dòng)聽性腦干反應(yīng)法(AABR)+耳聲發(fā)射法(OAE)、PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)對(duì)新生兒耳聾的篩查結(jié)果，比較聽力篩查結(jié)果為耳聾的患兒和正常聽力新生兒的耳聾基因檢出率，分析GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因的9個(gè)突變位點(diǎn)在耳聾患兒和正常聽力新生兒中的分布情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4—11月于本院出生的2 145例新生兒作為研究對(duì)象，其中男1 098例，女1 047例；出生體質(zhì)量2 758～4 367 g，平均(3 438.83±588.48)g。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1聽力篩查 采用AABR+OAE在新生兒出生2 d時(shí)進(jìn)行聽力初篩，未通過者在出生42 d時(shí)行聽力復(fù)查，仍未通過者在出生3個(gè)月時(shí)行聽力診斷性檢查，確定是否為耳聾。

1.2.2PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù) 抽取100 μL全血進(jìn)行抗凝處理，采用潮州凱普生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。從數(shù)據(jù)庫中選取GJB2基因、GJB3基因、sLc26A4基因、mtDNA基因序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物，對(duì)GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因2168A>G、IVS7-2A>G，mtDNA基因1494C>T、1555A>G共9個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。取2 μL提取好的DNA標(biāo)本作為模板，取28 μL擴(kuò)增試劑，一同加入PCR反應(yīng)管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 9 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min，16 ℃ 10 s。將PCR產(chǎn)物于95 ℃變性5～10 min，冰水浴2 min。進(jìn)行膜條雜交，準(zhǔn)備好雜交儀后，加入已變性的PCR產(chǎn)物DNA到已預(yù)熱至45 ℃的0.8 mL雜交液中，混勻，進(jìn)行20 min導(dǎo)流雜交。然后用45 ℃的洗脫液沖洗膜3～4次，每次間隔5 s，每次0.8 mL；調(diào)整溫度為25 ℃，用0.5 mL封阻液封閉膜，重復(fù)1次。加入0.5 mL酶標(biāo)液，溫育5 min；調(diào)整溫度至35 ℃，用溶液A(2×枸櫞酸鈉緩沖液、0.1%十二烷基磺酸鈉)徹底洗膜4次，每次0.8 mL。加入0.5 mL顯色液，顯色6 min；用雜交液洗膜3次，每次0.8 mL，再用2.0 mL蒸餾水漂洗，1 h內(nèi)分析結(jié)果。

1.3觀察指標(biāo) 分析AABR+OAE篩查結(jié)果；比較耳聾患兒與正常聽力新生兒的耳聾基因檢出率；比較GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因2168A>G、IVS7-2A>G，mtDNA基因1494C>T、1555A>G 9個(gè)突變位點(diǎn)在耳聾患兒和正常聽力新生兒中的分布情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1AABR+OAE篩查結(jié)果 2 145例新生兒中，有2 106例通過篩查，為正常聽力新生兒；有39例(1.82%)未通過篩查，在行聽力診斷性檢查中判定為耳聾，其中輕度、中度、中重度、重度耳聾分別為7、11、13、8例。

2.2耳聾患兒與正常聽力新生兒的耳聾基因檢測(cè)結(jié)果比較 39例耳聾患兒中共檢出9例患兒攜帶耳聾基因，檢出率為23.08%，正常聽力新生兒中共檢出66例攜帶耳聾基因，構(gòu)成比為3.13%，耳聾患兒耳聾基因檢出率高于正常聽力新生兒(χ2=45.134，P<0.001)。

2.3耳聾基因突變位點(diǎn)在耳聾患兒與正常聽力新生兒中的分布情況比較 耳聾基因中，GJB2基因235delC突變位點(diǎn)構(gòu)成比最高，占52.00%(39/75)。耳聾患兒與正常聽力新生兒GJB2基因35delG、176del16、235delC、299delAT，mtDNA基因1494C>T、1555A>G，GJB3基因538C>T，sLc26A4基因IVS7-2A>G、2168A>G 9個(gè)突變位點(diǎn)的構(gòu)成比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 耳聾基因突變位點(diǎn)在耳聾患兒與正常聽力新生兒中的分布情況比較[n(%)]

3 討 論

耳聾是常見的新生兒出生缺陷，可對(duì)患兒智力、語言的發(fā)育造成不良影響[5]。因此，早期對(duì)新生兒進(jìn)行聽力篩查和診斷，并采取相應(yīng)的措施具有重要意義。目前，新生兒聽力篩查主要采用AABR+OAE，AABR篩查耳蝸以后部位異常導(dǎo)致的聽力障礙，OAE篩查耳蝸以前部位異常導(dǎo)致的聽力障礙，AABR+OAE篩查可全面覆蓋聽力傳導(dǎo)過程中各部位異常導(dǎo)致的聽力障礙[6]，但未通過AABR+OAE篩查的新生兒需要在3個(gè)月后才能進(jìn)行聽力診斷性檢查，整個(gè)診斷過程耗時(shí)較長，可能會(huì)延誤治療的最佳時(shí)機(jī)。

相關(guān)研究表明，遺傳也是導(dǎo)致耳聾的主要因素，有耳聾基因的新生兒其聽力在出生后可能沒有異常，但可能在以后的成長過程中出現(xiàn)聽力障礙，因此檢測(cè)耳聾基因可彌補(bǔ)聽力篩查的不足[7]。對(duì)于耳聾基因的檢測(cè)，目前常用的有微陣列基因芯片法、熒光PCR法等，但微陣列基因芯片法價(jià)格較高，熒光PCR法因檢測(cè)通道限制而不能夠同時(shí)檢測(cè)基因的多個(gè)突變位點(diǎn)，操作較為復(fù)雜。PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)只需將探針的膜條與擴(kuò)增序列一次性雜交，即可對(duì)DNA中的多種突變進(jìn)行同時(shí)篩查，其原理是利用擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和標(biāo)記的探針雜交后的斑點(diǎn)雜交信號(hào)強(qiáng)弱來判斷是否突變，具有價(jià)格便宜、操作方便等優(yōu)點(diǎn)[8]。本研究中，AABR+OAE篩查時(shí)，共有39例(1.82%)患兒未通過，最終在聽力診斷性檢查中判定為耳聾；PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)共檢測(cè)出75例耳聾基因攜帶者，包括9例耳聾患兒和66例正常聽力新生兒，耳聾患兒的耳聾基因檢出率明顯高于正常聽力新生兒。上述結(jié)果表明，耳聾基因突變?cè)诙@患兒中的檢出率較高，是導(dǎo)致新生兒耳聾的重要原因，與張小娥等[9]的研究結(jié)果相同。

GJB2基因是導(dǎo)致遺傳性非綜合征型耳聾的常見基因，有研究表明，耳聾基因中GJB2基因235delC突變位點(diǎn)的檢出率最高。GJB2基因與先天性聽力障礙有關(guān)，且該基因?qū)е碌亩@患者發(fā)病年齡多數(shù)為6個(gè)月至20歲，多數(shù)新生兒在出生后通過了聽力篩查，但在成長過程中會(huì)慢慢出現(xiàn)聽力障礙[10-11]。本研究分析了常見的4個(gè)遺傳性非綜合征型耳聾基因的9個(gè)突變位點(diǎn)，結(jié)果顯示，耳聾基因中，GJB2基因235 delC突變位點(diǎn)構(gòu)成比最高，占52.00%(39/75)，結(jié)果與彭陸衡[12]的研究結(jié)果類似。本研究結(jié)果還顯示，耳聾患兒與正常聽力新生兒9個(gè)突變位點(diǎn)的構(gòu)成比比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明耳聾患兒與正常聽力新生兒不同耳聾基因的突變位點(diǎn)分布無明顯差異。

綜上所述，采用AABR+OAE對(duì)耳聾進(jìn)行初篩，再聯(lián)合PCR-導(dǎo)流雜交技術(shù)對(duì)耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)可篩查出各種致聾基因，早期指導(dǎo)臨床對(duì)耳聾患兒進(jìn)行干預(yù)，改善其預(yù)后，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。