一株沙門菌裂解性噬菌體的分離鑒定與生物學(xué)特性研究

李帥華,易開放,楊影影,賀丹丹,潘玉善,苑 麗,胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450000)

沙門菌(Salmonella)屬于腸道致病菌,其感染人和動物后可引起傷寒、急性胃腸炎以及敗血癥等疾病,是全球范圍內(nèi)引起食物中毒的常見病原菌之一[1]；同時沙門氏菌感染與食品種類繁多有關(guān),其污染源從人類到食品加工設(shè)施不等[2]。目前沙門氏菌共有超過2600個血清型,在我國報道的已有292個[3]。沙門菌對畜牧養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了巨大的影響，已經(jīng)在全球范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟損失,并對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

以往由于過于依賴抗生素對沙門菌病進(jìn)行治療與防控,以及抗生素長期的不合理使用及濫用,致使細(xì)菌耐藥性問題逐漸加劇,導(dǎo)致或誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生變異,甚至產(chǎn)生多重耐藥或泛耐藥的“超級細(xì)菌”。另外,抗生素的種類有限，且新抗生素的研發(fā)速度無法趕上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度,有研究證實:一種新的抗生素從發(fā)現(xiàn)到應(yīng)用至少需要5年時間,而細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性一般僅需要2年時間[4],因此針對沙門菌防控的新策略和產(chǎn)品亟待研究。

噬菌體(bacteriophage, phage)是一種細(xì)菌性病毒,廣泛存在于自然界,是生物圈中最豐富的物種。噬菌體是細(xì)菌的天敵,能夠天然殺滅細(xì)菌,在細(xì)菌治療方面較抗生素具有不可比擬的優(yōu)勢:嚴(yán)格的宿主特異性、增殖速度快、研發(fā)時間短、成本低、安全無污染等,使得噬菌體有望成為一種防控沙門菌的新型武器。本試驗以沙門菌SA209為宿主菌,分離得到了1株沙門菌噬菌體,并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,以期為噬菌體抗菌制劑的開發(fā)提供理論依據(jù)，為沙門菌的防控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株與樣品采集

宿主菌株SA209以及其它試驗所用菌株均由本實驗室保存,樣品采自河南省安陽市某規(guī)模化養(yǎng)豬場。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

瓊脂糖、DNase I、RNase A(TaKaRa)、SM緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)、SS瓊脂、LB肉湯、LB瓊脂均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 噬菌體的分離與鑒定

噬菌體的分離方法參照文獻(xiàn)[5]并有所改進(jìn)。將適量的糞便樣品完全溶解在SM緩沖液中,室溫靜置8 h,以10000 r/min離心10 min；上清液用0.48 μm的一次性無菌過濾器過濾,再次以10000 r/min離心10 min,再用0.22 μm的一次性無菌過濾器過濾。污水樣品以10000 r/min離心10 min,上清液用0.22 μm的一次性無菌過濾器過濾,即獲得噬菌體原液。將5 mL噬菌體原液和20 mL宿主菌液混合,37 ℃培養(yǎng)過夜。在培養(yǎng)物中加入適量的氯仿，振蕩20 min,以10000 r/min離心10 min,上清液即為噬菌體溶液。

將宿主菌液均勻涂布在LB平板上,滴加10 μL噬菌體溶液,對照組滴加等量的無菌水,待平板干燥后置于37 ℃培養(yǎng)12 h,觀察是否出現(xiàn)噬菌斑。

1.4 噬菌體的純化與保存

通過雙瓊脂平板法純化噬菌體:將噬菌體溶液以10倍梯度稀釋5次；將200 μL細(xì)菌液和100 μL噬菌體溶液加入到5 mL半固體培養(yǎng)基中，混合均勻后倒在LB平板上,將平板干燥后,在37 ℃下培養(yǎng)12 h。在雙板上形成斑塊后,用無菌牙簽挑取形狀規(guī)整、大而透亮的單個噬菌斑,加入1 mL SM溶液,于4 ℃放置6 h。重復(fù)上述操作,將單個噬菌體重復(fù)純化5～7次,以獲得純化后的噬菌體。

在5 mL宿主細(xì)菌溶液中加入100 μL噬菌體純化液,在37 ℃靜置30 min。然后,將培養(yǎng)物在37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)6 h。加入50 μL氯仿,劇烈振動15 min,再以7000 r/min離心20 min。將噬菌體溶液與80%甘油溶液(甘油終濃度為30%)混合,在-80 ℃下長時間保存,或在4 ℃下適時保存，備用。

1.5 噬菌體的效價計算

取純化后的噬菌體溶液100 μL，加入900 μL SM緩沖溶液,以10倍梯度倍比稀釋6次,使用雙層平板法測定噬菌體的滴度,試驗重復(fù)3次，取平均值。計算公式為:噬菌體滴度(PFU/mL)=稀釋倍數(shù)×噬菌斑個數(shù)×10。

1.6 噬菌體核酸類型的鑒定

取純化后的噬菌體顆粒,參考《分子克隆實驗指南》中的λ噬菌體顆粒PEG沉淀提取法[7]制備噬菌體濃縮液,用Virus DNA/RNA Kit試劑盒提取噬菌體的基因組,用DNase I、RNase A進(jìn)行酶溶鑒定。試驗組:12 μL基因組+2 μL DNase I/RNase A+6 μL ddH2O。對照組:12 μL基因組+8 μL ddH2O。于37 ℃恒溫金屬浴30 min,通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.7 最佳感染復(fù)數(shù)

感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)是指初始感染時加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值,也稱感染倍數(shù)。本試驗設(shè)定0.001、0.01、0.1、1、10、100等6個不同的感染復(fù)數(shù),將噬菌體純培養(yǎng)物和宿主菌按照不同感染復(fù)數(shù)的比例混合,補加液體LB培養(yǎng)基使各試管的總體積相同；將各試管置于37 ℃搖床上，以180 r/min振蕩4 h,離心取上清,適當(dāng)稀釋后利用雙層平板法測定各個感染復(fù)數(shù)下噬菌體的效價,以確定噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。

1.8 一步生長曲線

噬菌體的一步生長曲線是定量描述毒性噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線。實驗方法參照文獻(xiàn)[8],將對數(shù)生長期的宿主菌液以5000 r/min離心10 min，棄上清，用新鮮的LB肉湯重懸菌液,將菌液濃度定值到109cfu/mL;按最佳感染復(fù)數(shù)加入相應(yīng)的噬菌體量,在37 ℃下以180 r/min在搖床上培養(yǎng)15 min；再冰浴30 s,然后以10000 r/min離心10 min,用新鮮的LB肉湯洗滌兩次，除去未吸附的噬菌體;再用37 ℃預(yù)熱的LB肉湯進(jìn)行重懸,然后置于37 ℃、220 r/min的搖床培養(yǎng)并開始計時;分別在培養(yǎng)0、5、10、20、30、......、150 min時取樣500 μL,冰浴30 s,于4 ℃下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,收集上清液，測定噬菌體的滴度(PFU/mL)。以感染時間t為橫坐標(biāo),以噬菌體滴度為縱坐標(biāo),繪制一步生長曲線,得出噬菌體的潛伏期、裂解期,并計算裂解量，其計算公式為:裂解量=裂解末期噬菌體的滴度/感染初期的宿主菌濃度。

1.9 噬菌體的pH穩(wěn)定性

用HCI和NaOH溶液調(diào)節(jié)SM緩沖液的pH值,設(shè)置其pH值梯度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。分別取各pH值的SM緩沖液0.9 mL和噬菌體純培養(yǎng)物0.1 mL于無菌的EP管中，混勻，于37 ℃恒溫水浴2 h。然后對各梯度的混合培養(yǎng)液取樣，稀釋后測定噬菌體的效價；設(shè)置3次平行實驗，求平均值。以pH值為橫坐標(biāo)，以噬菌體的效價為縱坐標(biāo)作圖。

1.10 噬菌體的熱穩(wěn)定性

將適量的噬菌體純培養(yǎng)物分別靜置于40、50、60、70、80 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi),開始計時,分別在20、40、60 min時取樣,測定不同溫度不同時刻的噬菌體滴度；設(shè)置3個平行實驗，計算平均值。以時間為橫坐標(biāo),以噬菌體的滴度為縱坐標(biāo)作圖。

1.11 噬菌體的宿主譜初測

宿主譜測定采用點滴法:取100 μL測試菌液，將其均勻涂布在LB平板上,靜置干燥后,取20 μL噬菌體純培養(yǎng)物滴在平板的相應(yīng)區(qū)域,待其晾干后于37 ℃倒置過夜培養(yǎng)。觀察是否有裂解斑,若有裂解斑出現(xiàn)則證明噬菌體可裂解此株菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化

本研究從污水樣品中分離純化得到1株沙門菌噬菌體,將其命名為SA-1。采用雙層平板法純化該噬菌體,可見SA-1的噬菌斑呈圓形,大而透亮,直徑為3～5 mm,邊緣清晰,無暈環(huán)(如圖1)。

圖1 噬菌體SA-1的純化噬菌斑

2.2 噬菌體的效價測定

將噬菌體SA-1純化后,測定其效價，為1.15×1010PFU/mL。

2.3 噬菌體核酸酶切鑒定

如圖2所示:噬菌體SA-1基因組陰性對照組、RNase A酶溶組均有明亮的條帶,條帶大小、位置基本一致;只有DNase I酶溶組沒有條帶。說明噬菌體SA-1基因組對DNA酶敏感,可以被DNA酶溶解,由此可判定噬菌體SA-1基因組的核酸類型為DNA。

M: Marker; 1: SA-1陰性對照;2: DNase I酶溶組; 3: RNase A酶溶組。

2.4 最佳感染復(fù)數(shù)

由圖3可見,噬菌體SA-1在MOI=0.001時,噬菌體的滴度最高,達(dá)1.3×1012PFU/mL。因此,可確定噬菌體SA-1的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001。

圖3 噬菌體SA-1的感染復(fù)數(shù)

2.5 一步生長曲線

由圖4可知：噬菌體SA-1在感染宿主菌后的10 min內(nèi)效價變化不明顯,表明其潛伏期為10 min；在感染后10～30 min內(nèi)噬菌體的效價急劇升高,在感染30 min之后趨于平穩(wěn),表明其裂解期時長為20 min,在30 min之后進(jìn)入穩(wěn)定期。根據(jù)裂解量的計算公式，可以計算出噬菌體SA-1的裂解量為108 PFU/cell。

圖4 噬菌體SA-1的一步生長曲線

2.6 噬菌體的pH穩(wěn)定性

由圖5可知：噬菌體SA-1的效價在pH為2和12時為0,表明其不能生長；在pH為4～8時，其效價變化不明顯,而且維持在較高水平；在pH為8～11時,其效價稍微下降,但幅度較小,依然維持在較高的數(shù)量級。總體表明,噬菌體SA-1在較大的pH范圍內(nèi)依然可以保持活性,說明其對酸堿有著良好的耐受性。

圖5 噬菌體SA-1的pH穩(wěn)定性

2.7 噬菌體的熱穩(wěn)定性

由圖6可知：噬菌體SA-1在40 ℃和50 ℃下,其效價隨著時間的增加而出現(xiàn)升高或降低的現(xiàn)象,但都維持在較高的數(shù)量級,說明其在40～50 ℃下能維持良好的活性;在60、70、80 ℃條件下,噬菌體的效價處于直線下降狀態(tài),在20 min時其效價均為0,說明其在60～80 ℃的環(huán)境中會喪失活性。所以噬菌體SA-1的最適生長溫度為40～50 ℃。

圖6 噬菌體SA-1的熱穩(wěn)定性

2.8 噬菌體的宿主譜初測

本次實驗采用點滴法測定噬菌體SA-1的宿主范圍。從實驗室保存菌株中選取30株菌株:沙門氏菌臨床分離株17株、大腸桿菌臨床分離株11株、沙門氏菌JS標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及大腸桿菌ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株。研究發(fā)現(xiàn)：在JS和17株沙門菌臨床分離株中有7株對該噬菌體敏感；在ATCC25922標(biāo)準(zhǔn)菌株和11株大腸桿菌臨床分離株中有4株對該噬菌體敏感。說明噬菌體SA-1對沙門菌有較強的裂解能力,同時對大腸桿菌也表現(xiàn)出一定的裂解能力。

3 討論

沙門菌病是由沙門菌引起的人和動物食源性疾?。荒承┭逍蜕抽T菌例如鼠傷寒沙門菌感染畜禽后呈潛伏狀態(tài),雖無明顯病癥,但會持續(xù)排菌,以及污染其下游相關(guān)產(chǎn)品，是沙門菌引起食源性疾病的主要原因,不僅極大地提高了食源性致病菌擴散的風(fēng)險,而且嚴(yán)重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，危害了人類健康。

噬菌體在自然界分布廣泛,可以說幾乎有細(xì)菌存在的地方就有其相應(yīng)的噬菌體存在。據(jù)Brussow H等[9]報道,地球大約有1032個噬菌體存在,其數(shù)量相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)量的十幾倍。根據(jù)噬菌體的作用方式可以將其分為溶原性噬菌體和烈性噬菌體兩大類,其中溶原性噬菌體在感染細(xì)菌后,其遺傳物質(zhì)會整合到細(xì)菌的遺傳物質(zhì)上,隨細(xì)菌遺傳物質(zhì)復(fù)制而復(fù)制,在正常情況下不會大量繁殖,故而達(dá)不到裂解宿主菌的效果;而烈性噬菌體在感染宿主細(xì)菌后,會在其內(nèi)部迅速大量繁殖,從而裂解宿主菌。烈性噬菌體雖然會對細(xì)菌造成巨大的殺傷,但是對人和動物是安全的,不會產(chǎn)生威脅[10]。

本研究從河南省安陽市某規(guī)?；B(yǎng)殖場污水樣品中分離到沙門菌噬菌體SA-1；純化后，其在平板上形成的噬菌斑大而透亮，邊緣清晰，無暈環(huán),直徑在3～5 mm。在本研究中，噬菌體SA-1的初始效價測定為1.15×1010PFU/mL,高于陳義寶等[11]測定的腸炎沙門氏菌噬菌體SP01的效價1.2×109PFU/mL、仇笑笑等[12]測定的沙門菌噬菌體CR5的效價109PFU/mL,說明SA-1屬于高效價噬菌體,對沙門菌具有更高的殺傷力。噬菌體SA-1經(jīng)DNase I酶、RNase A酶酶切分析后,判定其遺傳物質(zhì)為DNA。本研究測定發(fā)現(xiàn)，噬菌體SA-1的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001,說明SA-1在感染宿主沙門菌時,很小的數(shù)量級就能發(fā)揮出良好的裂解性能,這也是在實際抗菌應(yīng)用中噬菌體相對于抗生素的優(yōu)勢體現(xiàn)。SA-1的生長曲線顯示：其潛伏期為0～10 min，裂解期為10～30 min,在30 min后進(jìn)入穩(wěn)定期,裂解量高達(dá)108 PFU/cell。與Tang F等[5]和Cai R P等[13]分離的噬菌體相比,噬菌體SA-1的潛伏期短,暴發(fā)期更短,能夠更快地殺滅細(xì)菌。SA-1的裂解量達(dá)108 PFU/cell,高于江艷華等[14]報道的沙門菌裂解性噬菌體的裂解量(51 PFU/cell)、包紅朵等[15]報道的腸炎沙門菌的裂解量(22 PFU/cell)。SA-1對溫度和pH表現(xiàn)出較強的耐受性,在pH為3～11區(qū)間內(nèi)活性穩(wěn)定，在50 ℃內(nèi)活性穩(wěn)定,在60 ℃及更高溫度下其活性會逐漸降低,比趙影等[16]報道的鼠傷寒沙門氏菌噬菌體ΦBLCC8-0050-3(其適宜溫度為30～50 ℃，適宜pH值為5～10)和Imam M等[17]報道的噬菌體MIJ3(其適宜溫度為30～60 ℃，適宜pH值為3～10)的適應(yīng)范圍廣。噬菌體SA-1能夠裂解沙門氏菌JS標(biāo)準(zhǔn)菌株、多株除宿主沙門菌外的沙門菌臨床分離株，以及幾株大腸桿菌臨床分離株,說明SA-1對沙門菌具有良好的裂解性能。盡管噬菌體自身具有較強的特異性,但在本實驗中涉及的幾株大腸桿菌臨床分離株也對噬菌體SA-1表現(xiàn)出了敏感性,此現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述,噬菌體SA-1屬于裂解性噬菌體,不僅對沙門菌有較強的裂解能力,還具有較強的溫度及酸堿耐受性,體現(xiàn)出很高的應(yīng)用價值,有希望成為一種新型的治療沙門菌病的武器,值得進(jìn)一步研究。