利用非手性－手性色譜－預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測法分析中藥前胡化學(xué)成分

許霞　李婷　曹麗波　賈金茹　龔興成　李軍　屠鵬飛　王一濤　宋月林

摘 要 前胡等中藥不僅化學(xué)成分組成復(fù)雜， 而且常含有大量對映異構(gòu)體， 且對映異構(gòu)體之間的含量常存在差異。本研究以中藥前胡為例， 建立了非手性-手性色譜-預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測法（Achiral-chiral LC-predictive MRM）， 實現(xiàn)了化學(xué)成分的化學(xué)選擇性和立體選擇性分析。非手性-手性色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)結(jié)合了RP-C18色譜柱的高效分離能力以及手性色譜柱的立體選擇性分離優(yōu)勢， 有效避免了中心切割非手性-手性二維液相構(gòu)造復(fù)雜、 精密度差等缺陷。采用小內(nèi)徑核殼型RP-C18色譜柱作為前端化學(xué)分離柱， 實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)類似香豆素的高效化學(xué)選擇性分離; 通過在手性柱前引入稀釋泵， 優(yōu)化適用于手性選擇性分離的洗脫程序; 采用反相大內(nèi)徑AD-RH手性色譜柱， 實現(xiàn)了對映異構(gòu)體的手性拆分。采用預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式實現(xiàn)化學(xué)成分的高靈敏度檢出， 并利用增強子離子掃描模式采集各色譜峰的二級質(zhì)譜， 進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。從前胡中鑒定出61種化學(xué)成分， 其中包括11對對映異構(gòu)體。Achiral-chiral LC-predictive MRM為含有對映異構(gòu)體的中藥及其它復(fù)雜樣品的深入定性和定量分析提供了可靠的方法。

關(guān)鍵詞 非手性-手性色譜; 預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式; 對映異構(gòu)體拆分; 角型吡喃香豆素; 中藥; 前胡

1 引 言

中藥和生物樣品等化學(xué)成分組成極其復(fù)雜， 常含有成百上千種化學(xué)成分[1]， 給分離提出了極大的挑戰(zhàn)。近年來， 隨著各種色譜填料的快速發(fā)展以及二維、 多維液相色譜的不斷涌現(xiàn)， 選擇性分離技術(shù)取得了較大進(jìn)步。尤其是核殼色譜柱的出現(xiàn)， 為復(fù)雜體系的化學(xué)成分分析提供了有力的工具。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）由于同時具備定性和定量分析的特點， 已被廣泛應(yīng)用于中藥等復(fù)雜樣品的分離分析[2]。中藥化學(xué)成分組成復(fù)雜， 常含有大量的結(jié)構(gòu)類似物， 并常含有對映異構(gòu)體， 目前對于異構(gòu)體的分離主要有色譜法和非色譜法， 色譜法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[3，4]、 氣相色譜法（GC）[5]、 毛細(xì)管電泳法（CE）[6]以及超臨界流體色譜法（SFC）[7]， 非色譜法主要包括化學(xué)分離法[8]、 結(jié)晶分離法[9]、 膜分離法[10]以及動力學(xué)分離法等[11]。目前中藥中對映異構(gòu)體的分離大多采用液相色譜法， 中心切割非手性-手性色譜分離系統(tǒng)[12，13]在實現(xiàn)手性分離的同時還可以對異構(gòu)體的含量進(jìn)行測量， 是最為常用的方法。然而， 該系統(tǒng)存在以下缺陷： 系統(tǒng)的構(gòu)成復(fù)雜， 影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性; 在第一維液相保留時間出現(xiàn)漂移時， 切換閥難以成功捕獲目標(biāo)峰; 一般需要兩次或更多次樣品分析才能獲得對映異構(gòu)體的含量; 如果在對映異構(gòu)體的保留時間未設(shè)定柱切換， 則無法手性分離對映異構(gòu)體。本研究組在前期工作中， 建立了反相色譜和親水作用色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)（RPLC-HILIC）[14～16]， 其同步保留大、 中、 小極性化學(xué)成分的能力與柱切換反相色譜和親水作用色譜[17，18]基本相當(dāng)。RPLC-HILIC系統(tǒng)無需色譜柱切換， 儀器連接方便， 更適用于中藥復(fù)雜樣品的分離分析。

由于對映異構(gòu)體常表現(xiàn)出不同的生物活性， 在樣品中也并非以外消旋體（Racemate）形式存在[19]， 表現(xiàn)為其中一種構(gòu)型含量較高， 稱為優(yōu)映體（Optimal enantiomer）。因此， 對這些對映異構(gòu)體進(jìn)行手性分離， 深入揭示對映異構(gòu)體的含量差別， 具有重要的實用價值。為了闡明復(fù)雜樣品化學(xué)成分組成， 應(yīng)在實現(xiàn)化學(xué)選擇性分離的基礎(chǔ)上， 建立高效的手性分離系統(tǒng)， 深入揭示對映異構(gòu)體的含量差別和生物活性差異。然而， 手性色譜柱往往不具備較強的化學(xué)分離能力[20]， 而常用的RP-C18色譜柱雖然具有高效的分離能力， 但無法實現(xiàn)對映異構(gòu)體的手性分離。

前胡（Peucedani Radix）為我國傳統(tǒng)中藥， 《中國藥典（2015年版）》規(guī)定基原為傘形科植物白花前胡Peucedanum praerupterum Dunn的干燥根， 其性味苦， 辛， 微寒， 歸肺經(jīng)， 具散風(fēng)清熱， 降氣化痰之功效。臨床上主要用于風(fēng)熱感冒、 咳嗽痰多、 哮喘和胸悶等證[21，22]。角型吡喃香豆素類化合物（Angular-type pyranocoumarins， APs）是前胡中的主要化學(xué)成分群[19，22～27]， 也是前胡降氣化痰、 舒張血管的主要活性成分[28，29]， 如白花前胡甲素（dl-praeruptorin A）、 白花前胡乙素（dl-praeruptorin B）等。此外， 前胡中還含有簡單香豆素、 呋喃香豆素等化學(xué)類型。除各類結(jié)構(gòu)相似的香豆素外， 文獻(xiàn)還報道了前胡中的多組對映異構(gòu)體[19，25，27]， 這些對映異構(gòu)體并非以外消旋體的形式出現(xiàn)， 而是存在優(yōu)映體。并且， 對映異構(gòu)體間往往呈現(xiàn)不同藥理活性。如白花前胡丙素（d-praeruptorin A）為優(yōu)映體， 其在前胡中的含量、 擴張血管的活性以及代謝穩(wěn)定性均優(yōu)于其對映體l-praeruptorin A[19，28，30，31]。因此， 在對中藥前胡進(jìn)行化學(xué)成分輪廓分析時， 不但要對各種結(jié)構(gòu)類似的香豆素類成分進(jìn)行有效分離， 還應(yīng)對各組對映異構(gòu)體進(jìn)行手性拆分。

為了建立一種適用于復(fù)雜樣品化學(xué)成分分析的整合體系， 深入闡明前胡的化學(xué)組成成分， 本研究構(gòu)建了非手性色譜與手性色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)（Achiral-chiral LC）， 可同步實現(xiàn)前胡中結(jié)構(gòu)類似化學(xué)成分和對映異構(gòu)體的高效分離。核殼色譜柱因其具有更高的柱效、 更低的反壓以及更高的分析效率， 可進(jìn)行結(jié)構(gòu)類似物和非對映異構(gòu)體的化學(xué)選擇性分離; 涂敷型手性色譜柱填料可實現(xiàn)對映異構(gòu)體立體選擇性分離。由于前胡化學(xué)成分的相關(guān)報道已較多， 本研究采用預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式（Predictive MRM）[32，33]實現(xiàn)化學(xué)成分的高靈敏度檢出。本研究構(gòu)建的Achiral-chiral LC-predictive MRM體系為含有對映異構(gòu)體的中藥化學(xué)成分深入定性與定量分析提供了可靠的方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

賽默飛U-3000雙三元高效液相色譜儀（美國Thermo-Fisher公司）， 配備兩個三元泵（左泵和右泵）、 柱溫箱、 自動進(jìn)樣器和紫外檢測器; SCIEX Qtrap5500質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）， 配備ESI離子源， 質(zhì)譜檢測由自動進(jìn)樣器觸發(fā);? XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）; Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; XW-80A漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）; PREMIXER ASSY混合器（日本Shimadzu公司）。

甲醇（色譜純）、 甲酸和乙腈（質(zhì)譜純）， 購于美國Thermo-Fisher公司; 實驗用水為Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水（18.2 MΩ·cm）; 甲醇（分析純， 北京化工廠）。中藥前胡購于北京同仁堂，經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院屠鵬飛教授鑒定為白花前胡（Peucedanum praeruptorum Dunn.）的干燥根， 標(biāo)本存放于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥現(xiàn)代研究中心標(biāo)本庫。

2.2 實驗方法

2.2.1 溶液的配制 前胡藥材切成片， 在40℃烘箱中干燥處理4天后， 用粉碎機粉碎并過篩。精密稱取1.0 g干燥粉末于具塞三角瓶中， 加入50%甲醇定容至50 mL， 稱定重量， 超聲處理30 min， 放冷， 再次稱定重量， 用50%甲醇補足失重， 搖勻， 靜置， 上清液過0.22 μm濾膜， 吸取續(xù)濾液500 μL， 待測。

2.2.2 液相色譜條件 液相系統(tǒng)連接方式如圖1所示[16]。使用U-3000雙三元色譜儀的左泵和右泵提供稀釋溶劑， 利用PEEK管將非手性柱和手性柱在線連接。為了解決非手性柱和手性柱流動相不兼容的問題， 引入右泵提供豐富的水和乙腈溶劑; 為了防止來自左泵和右泵的兩股流動相在混合時產(chǎn)生氣泡， 選用PREMIXER ASSY混合器將兩股流動相充分混合， 混合后的溶劑直接進(jìn)入手性柱進(jìn)行在線洗脫。具體參數(shù)如下：? Capcell core RP-C18非手性色譜柱（150 mm×2.1 mm， 2.7 μm， 日本Shiseido公司）;? AD-RH手性色譜柱（150 mm×4.6 mm， 5.0 μm， 日本Daicel公司）。左泵輸送泵流動相A（0.1%甲酸）和流動相B（乙腈）， 梯度洗脫程序： 0～4 min， 10%B; 4～15 min， 10%～25%B; 15～23 min， 25%～50%B; 23～28 min， 50%～57%B; 28～34 min， 57%～67%B; 34～44 min， 67%～68%B; 44～56 min， 68%B; 56～60 min， 68%～95%B; 60～60.1 min， 95%～10%B; 60.1～66 min， 10%B; 總流速為0.3 mL/min。右泵輸送泵流動相C（0.1%甲酸）和流動相D（乙腈）， 梯度洗脫程序：? 0～4 min， 95%～86%B; 4～15 min， 86%～70% B; 15～23 min， 70%～50% B; 23～28 min， 50%～47% B; 28～34 min， 47%～43%B; 34～44 min， 43%～42%B; 44～56 min， 42%B; 56～60 min， 42%～21%B; 60～60.1 min， 21%～95%B; 60.1～66 min， 95%B; 總流速為0.7 mL/min。色譜柱均置于35℃柱溫箱中， 進(jìn)樣量2 μL。

2.2.3 Qtrap-MS條件 電噴霧離子源（ESI）， 正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式。氣簾氣： 35.0 psi （1 psi=6.89 kPa）; 碰撞氣： 高; 噴霧電壓： 5500 V; 霧化氣： 55 psi; 輔助氣： 55 psi; 霧化溫度： 550℃; 脫離子簇電壓（DP）： 100 V; Q1和Q3均為單位分辨率（0.6～0.8 Da）。每個離子對的采集時間（Dwell time）為10 ms。所有預(yù)測離子對、 相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)及對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)均來自于課題組前期報道[23]。每個化合物均采用兩對離子對（定量離子對和定性離子對）進(jìn)行檢測。由于對映異構(gòu)體質(zhì)譜行為完全一致， 而同分異構(gòu)體的定量離子對和定性離子對豐度比值常存在顯著差異[15，34]。因此， 本研究通過兩對離子對響應(yīng)值比例（QQR）判定兩個色譜信號是否為對映異構(gòu)體[34]。利用數(shù)據(jù)依賴性采集模式（IDA）觸發(fā)增強子離子掃描（EPI）模式采集各母離子的MS2圖譜。EPI實驗參數(shù)設(shè)置為： 碰撞能（CE）， 40 eV; 碰撞能量分散（CES）， 35 eV。利用Analyst 1.6.2軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜方法的建立

在前期建立反相色譜和親水作用色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)的過程中[16]， 測試了多個色譜柱， 選擇內(nèi)徑小、 柱效高的反相色譜柱作為前端分離柱， 分離效果更佳。因此， 本實驗篩選了多個候選色譜柱， 并利用Predictive MRM模式進(jìn)行化學(xué)成分的測定， 以色譜峰的形狀、 分離度作為指標(biāo)衡量色譜柱的分離效能。較之Phenomenex Kinetex-C18 shell column （100 mm×2.1 mm， 2.6 μm， 美國Phenomenex公司）、 ACE UltraCore 2.5 Super C18 column （150 mm×3.0 mm， 2.5 μm， 英國Advanced Chromatography Technologies公司）、 Waters Acquity UPLC HSS T3 column （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm， 美國Waters公司）等多款核殼型或新型填料高效色譜柱， 本研究選擇的Capcell core RP-C18色譜柱能夠較好地分離具有相似結(jié)構(gòu)的APs， 包括同分異構(gòu)體， 如Pteryxin （Pte）和Praeruptorin A （PA）、 Imperatorin和Isoimperatorin等。進(jìn)一步優(yōu)化了流動相洗脫程序、 流動相流速及流動相改性劑， 結(jié)果表明， 2.2.2節(jié)的洗脫程序和流速能使大多數(shù)色譜信號達(dá)到基線分離， 并且0.1%甲酸作為水相改性劑可以有效改善峰形， 典型圖譜如圖2A所示。

由于手性色譜柱對手性化合物手性中心的化學(xué)環(huán)境選擇性較高， 因此， 本研究選用已被證明對APs對映異構(gòu)體具有較好分離效果的AD-RH色譜柱[19，25，27，35]進(jìn)行立體選擇性分離， 其反相分離機制所需的流動相組成可與RP-C18兼容， AD-RH色譜柱和Capcell core RP-C18色譜柱都基于反向色譜分離機制， 樣品從第一維洗脫后， 由于流動相不匹配， 需要經(jīng)過稀釋， 降低流動相中溶劑的強度， 二者均使用水和乙腈作為流動相， 通過優(yōu)化洗脫程序， 兩者耦聯(lián)時溶劑可具有良好的兼容性。在前期研究中， 還發(fā)現(xiàn)3′S構(gòu)型能被AD-RH色譜柱率先洗脫[19]。C-3′和C-4′的取代基團(tuán)越大， 分離效果越差， 需采用更低比例的有機相、 提高洗脫時間才能達(dá)到較好分離， 而這些分離度較差的對映異構(gòu)體在RP-C18色譜柱上常表現(xiàn)出較好的色譜保留。因此， 本研究在RP-C18和AD-RH色譜柱之間引入稀釋泵， 逐步降低有機相比例， 并采用0.7 mL/min的流速梯度洗脫， 實現(xiàn)對映異構(gòu)體良好的手性分離。Achiral-chiral-predictive MRM典型色譜圖見圖2B 。

3.2 異構(gòu)體的判別

在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下， 雖然保留時間可以作為化合物判定的依據(jù)， 但確認(rèn)所檢測的信號是否來自目標(biāo)分析物仍具有挑戰(zhàn)。通過定量離子對和定性離子對比值（QQR）結(jié)合MS2質(zhì)譜信號對化合物進(jìn)行雙重鑒定以增加結(jié)構(gòu)判定的準(zhǔn)確性。本研究組前期工作已經(jīng)證明3′S構(gòu)型能被AD-RH色譜柱率先洗脫[19]， 根據(jù)定量離子對和定性離子對的比值判定是否為對映異構(gòu)體[15，34]， 并且對映異構(gòu)體在achiral-chiral系統(tǒng)上的保留時間大于在單柱RP-C18色譜柱上的保留時間， 本研究發(fā)現(xiàn)cis-Khellactone （CKL， 5 vs. 6）、 Qianhucoumarin G （QC-G， 7 vs. 8）、 Oxypeucedanin hydrate （OPH， 9 vs. 10）、 3′-Angeloyloxy-4′-oxo-3′，4′-dihydroseselin （AOD， 27 vs. 30）、 Pte （35 vs. 40）、 PA （37 vs. 41）、 cis-3′-Isovaleryl-4′-acetylkhellactone （IAK， 39 vs. 44）、 Qianhucoumarin J （QC-J， 42 vs. 45）、 Praeruptorin B （PB， 52 vs. 54）、 Praeruptorin E （PE， 55 vs. 58）、 cis-3′，4′-diisovalerylkhellactone （DIK， 59 vs. 60） 共11對對映異構(gòu)體， 均獲得了較好的立體選擇性分離。除QC-G和OPH為線性呋喃香豆素類化學(xué)成分， 其余9對對映異構(gòu)體均為APs， 且為CKL的衍生物。以PA為例， 定量離子對和定性離子對分別為m/z 409>227和m/z 409>245， 首先通過針泵注射將化合物注入質(zhì)譜儀， 對PA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行含量測定， 經(jīng)過計算PA的QQR=1.82。隨后對前胡樣品進(jìn)行分析， 利用構(gòu)建的Achiral-chiral系統(tǒng)實現(xiàn)化學(xué)成分的立體選擇性分析， 發(fā)現(xiàn)PA通過手性柱拆分得到兩種成分， 分別為（3′S）-PA和（3′R）-PA，? 計算得到兩者的QQR均為1.82， 結(jié)合碎片離子進(jìn)行驗證， 判定二者為對映異構(gòu)體?；衔颬A的定量和定性分析色譜圖如圖3A所示， MS2質(zhì)譜信息如圖3B所示。值得注意的是， Pte和PA的對映異構(gòu)體在中心切割非手性-手性二維液相中未能獲得較好分離， 但在Achiral-chiral系統(tǒng)中獲得了較好的手性分離。

3.3 結(jié)構(gòu)鑒定及質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.3.1 前胡化學(xué)結(jié)構(gòu)表征 由于本研究采用預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測各化學(xué)成分， 預(yù)測離子對在編入檢測離子隊列（Monitoring list）均對應(yīng)了可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)（Putative identity）。因此， 只需要利用EPI提供的MS2圖譜中的主要碎片離子結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證即可。同時， 利用3.2節(jié)規(guī)定的對映異構(gòu)體的定量離子對和定性離子對的比值應(yīng)完全一致判定對映異構(gòu)體[15，34]。對所有響應(yīng)值大于500 cps且信噪比（S/N）大于100的信號進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證， 初步鑒定了61種化學(xué)成分。各化合物的保留時間、 預(yù)測離子對、 主要碎片離子以及可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)見表1。

APs為中藥前胡的主要化學(xué)類型， 此外還含有少量的線性呋喃香豆素（LFs）、 角型呋喃香豆素（AFs）、 簡單香豆素（SCs）等其它化學(xué)類型[22]。對于線性呋喃香豆素、 角型呋喃香豆素、 簡單香豆素等化學(xué)類型[36，37]， 其質(zhì)譜裂解規(guī)律已被廣泛報道， 特征性裂解途徑主要由取代基引起。在正離子模式下， 香豆素類化合物易產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+或加合離子峰[M+Na]+及[M+NH4]+。大部分APs的C-3′和C-4′為順式構(gòu)型， 由結(jié)構(gòu)母核cis-khellactone在C-3′和C-4′的羥基結(jié)合不同的?；≧和R′）生成， 如當(dāng)歸酰基、 千里光?；?、 乙酰基、 正丁?；?、 異戊酰基等[22]。對于LFs， 主要由于C-5和C-8位取代基的不同， 從而生成不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 如異戊氧基、 甲氧基、 糖基等。

3.3.2 角型吡喃香豆素類 從前胡提取物中共鑒定出46個APs， 包括9對對映異構(gòu)體（5和6、 27和30、 35和40、 37和41、 39和44、42和45、52和54、 55和58、 59和60）， 大部分為CKL的衍生物， 通過QQR和MS2碎片對比驗證，? 確定對映異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)。對于APs， C-3′和C-4′的羥基結(jié)合不同的取代基生成不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)， 母離子進(jìn)入碰撞池（Collision cell）后， 具有較大共軛體系分散電荷的子離子常顯示出較高的豐度。由于C-4′處于香豆素母核的芐位， 可通過香豆素母核分散電荷， 形成更為穩(wěn)定的子離子。因此， APs先從C-4′中性丟失R′COOH， 進(jìn)而從C-3′中性丟失（R-H）CO形成特征性碎片離子m/z 245， 并進(jìn)一步通過中性丟失水分子形成另一個特征性碎片離子m/z 227。例如， Praeruptorin E（PE）為CKL的雙酯化產(chǎn)物， 在C-3′和C-4′位分別為當(dāng)歸?；彤愇祯；〈?， 分子式為C24H28O7， 準(zhǔn)分子離子峰m/z 451[M+Na]+， 主要的碎片離子為m/z 329[M+H-C4H9COOH]+、 m/z 327[M+H-C4H7COOH]+、 m/z 245[M+H-C4H9COOH-C4H6CO]+和m/z 227[M+H-C4H9COOH-C4H7COOH]+， 分別由母離子中性丟失C5H10O2（100 Da）、 C5H8O2（100 Da）和C4H6CO（60 Da）， 進(jìn)一步中性丟失H2O（18 Da）而得， 最終得到特征性碎片離子m/z 245和m/z 227。從PE二級質(zhì)譜圖（圖4A）中可知，? m/z 327的碎片離子響應(yīng)很高， 說明具有較大共軛體系分散電荷的子離子顯示出較高的豐度。PE二級質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑如圖4所示。當(dāng)C-3′或C-4′為羰基時， 如AOD， 還可觀察到m/z 261和m/z 243的特征性碎片離子。

3.3.3 線型呋喃香豆素類 除APs外， 前胡中還含有少量的LFs化學(xué)成分。從前胡中共鑒定出12個LFs，? 其中包括2對對映異構(gòu)體， 分別為化合物QC-G （7 vs. 8）和OPH （9 vs. 10）， 為首次從前胡中鑒定得到的對映異構(gòu)體。LFs通常在C-5或C-8位有取代基取代， 常見的取代基有異戊氧基、 甲氧基、 羥基、 糖基等。C-5或C-8取代基通過中性丟失而形成碎片離子 m/z 203， 隨后進(jìn)一步中性丟失CO （28 Da）和CO2（44 Da）， 分別產(chǎn)生m/z 175 和m/z 159的特征性碎片離子。以歐前胡素（Imperatorin）為例， 其分子式為C16H14O4， 準(zhǔn)分子離子峰m/z 271[M+H]+， C-5位具有異戊氧基取代， MS2圖譜可見m/z 203[M+H-C2H6O]+、 175[M+H-C2H6O-CO]+、 159[M+H-C2H6O-CO2]+、 147[M+H-C2H6O-2CO]+的碎片離子， 提示中性丟失C2H6O（46 Da）、 CO（28 Da）和CO2（44 Da）。Imperatorin二級質(zhì)譜圖和可能的裂解途徑如圖5所示?；衔锼涎趸昂兀∣xypeucedanin hydrate）也為線性呋喃香豆素， C-5位具有2′′，3′′-二羥基異戊氧基取代， 其主要質(zhì)譜行為由此取代基產(chǎn)生。母離子m/z 305[M+H]+進(jìn)入碰撞池后， 首先發(fā)生中性丟失C2OH6（46 Da）， 進(jìn)一步中性丟失C2O2（56 Da）， 分別產(chǎn)生子離子m/z 259和m/z 203。

4 結(jié) 論

建立了Achiral-chiral LC-predictive MRM系統(tǒng)， 并將其應(yīng)用于富含對映異構(gòu)體的中藥前胡化學(xué)成分組成的深入解析。非手性-手性色譜直接耦聯(lián)系統(tǒng)集成了RP-C18色譜柱的高效分離能力以及手性色譜柱的立體選擇性分離優(yōu)勢， 有效地避免了中心切割非手性-手性二維液相構(gòu)造復(fù)雜、 精密度差等缺陷。采用小內(nèi)徑核殼型RP-C18色譜柱作為前端化學(xué)分離柱， 實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)類似香豆素的高效化學(xué)選擇性分離; 通過在手性柱前引入稀釋泵， 構(gòu)建適用于手性選擇性分離的洗脫程序; 采用反相大內(nèi)徑AD-RH手性色譜柱， 實現(xiàn)了對映異構(gòu)體的手性拆分。采用預(yù)測多反應(yīng)監(jiān)測模式實現(xiàn)化學(xué)成分的高靈敏度檢出， 并利用增強子離子掃描模式采集各色譜峰的MS2圖譜， 結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。從中藥前胡中鑒定了61種化學(xué)成分， 包括11對對映異構(gòu)體， 其中46種化學(xué)成分為角型吡喃香豆素類化合物。Achiral-chiral LC-predictive MRM為含有對映異構(gòu)體的中藥前胡及其它復(fù)雜樣品的深入定性與定量分析提供了可靠的方法。

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Chemical Profiling of Peucedani Radix by Achiral-chiral

Liquid Chromatography-Predictive Multiple Reaction Monitoring

XU Xia1， LI Ting1， CAO Li-Bo1， JIA Jin-Ru1， GONG Xing-Cheng1， LI Jun1，2，

TU Peng-Fei1， WANG Yi-Tao3， SONG Yue-Lin1，2

1（Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine， School of Chinese Materia Medica，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

2（Beijing Key Lab for Quality Evaluation of Chinese Meteria Medica，

Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

3（State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine， Institute of Chinese Medical Sciences，

University of Macau， Taipa 999078， Macao， China）

Abstract Peucedani radix and other herbal medicines are not only complex in chemical composition， but also often contain a large number of enantiomers， and there are often differences in content of enantiomers. In this work， a new analytical platform namely achiral-chiral liquid chromatography （LC）-predictive multiple reaction monitoring was firstly configured for chemo- and enantio-selective separation of the components in Peucedani Radix， a well-known herbal medicine. Serially coupled achiral LC and chiral LC integrated the robust separation potential of RP-C18 column along with the enantio-separation advantage from chiral column， thus addressing the disadvantages of heart-cutting achiral-chiral two dimensional LC in terms of sophisticated instrumentation and unsatisfactory precision. The narrow-bore core-shell RP-C18 column was served as the front tool to accomplish efficient chemo-selective separation within those coumarins bearing similar chemical structures， a dilution pump was introduced between the two columns to facilitate the optimization of optimum elution program from the chiral column， and a wide-bore chiral column offered the enantio-separation potential for those enantiomers. Predictive MRM mode was deployed to sensitively detect the chemical components， and the enhanced product ion program was utilized to acquire MS2 spectra for all signals. Structure confirmation was conducted by matching the fragment ion species with the well-proposed fragmentation rules. As a result， 61 components， in total， were found from Peucedani Radix， including eleven pairs of enantiomers. Above all， achiral-chiral LC-predictive MRM is a promising tool for the quantitative and qualitative analysis of the complicated matrices， beyond herbal medicines， which are featured by enantiomerically enriched mixtures.

Keywords Achiral-chiral liquid chromatography; Predictive multiple reaction monitoring; Enantioseparation; Angular-type pyranocoumarins; Chinese medicine; Peucedani radix

（Received 11 August 2020; accepted 14 September 2020）

This work was supported by the National Key Research and Development Project of China （No. 2018YFC1707300）， the National Natural Science Foundation of China （Nos. 81773875， 81530097）， the Young Elite Scientists Sponsorship Program by CAST （No. 2017QNRC001）， the Young Scientist Program by Beijing University of Chinese Medicine （No. BUCM-2019-QNKXJB006）， and the Fundamental Research Funds for the Central Universities， China （No. 2020-JYB-ZDGG-041）.

2020-08-11收稿; 2020-09-14接受

本文系國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2018YFC1707300）、 國家科學(xué)自然基金項目（Nos. 81973444， 817738757）、 中國科協(xié)青年人才托舉工程項目（No. 2017QNRC001）、 北京中醫(yī)藥大學(xué)青年科學(xué)家培育計劃項目（No. BUCM-2019-QNKXJB006）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金（No. 2020-JYB-ZDGG-041）資助

* E-mail： syltwc2005@163.com