復(fù)方蒲公英顆粒劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

★ 張玉愛 郭智強(qiáng) 廖太祥 陳圓 黎莉萍（南昌市博澤康醫(yī)藥科技有限公司 南昌 330029）

復(fù)方蒲公英顆粒是由蒲公英、黃連、薏苡仁、茵陳等十二味中藥材制成的復(fù)方制劑，具有清泄肺胃積熱、解毒散結(jié)等功效。適用于濕熱毒蘊(yùn)結(jié)所致的痤瘡，脂溢性皮炎，玫瑰痤瘡，酒渣鼻，毛囊炎等病癥。原中藥處方?jīng)]有固定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，很難對藥品質(zhì)量進(jìn)行控制，為了保障在臨床中應(yīng)用的安全，因此有必要進(jìn)行相關(guān)的醫(yī)院制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［1-2］。

本文對該處方藥物進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，試驗(yàn)采用TLC法對處方中的蒲公英、黃連和薏苡仁進(jìn)行了定性鑒別，并以鹽酸小檗堿為定量指標(biāo)，研究了HPLC測定該成分的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察，最終建立起復(fù)方蒲公英顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床用藥的安全、有效和穩(wěn)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ2200DB型超聲波清洗機(jī)（昆山超聲波儀器有限公司）；ZF-2型紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；BS25S型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；APS-80-10D型高效液相色譜儀（德國沃特斯）；硅膠G板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200208，中國藥品生物制品檢定研究院）；蒲公英對照藥材（批號：121195-201503，中國藥品生物制品檢定研究院）；薏苡仁對照藥材（批號：121254-201504，中國藥品生物制品檢定研究院）；乙腈為色譜純；水為超純水（自制）；其它化學(xué)試劑均為分析純。復(fù)方蒲公英顆粒供試品三批（170504、170505、170506）及陰性樣品均由本公司制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 黃連的鑒別 黃連中的主要化學(xué)成分為鹽酸小檗堿［3］，故以鹽酸小檗堿進(jìn)行定性鑒別。①供試品溶液：取本品10 g，研細(xì)，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。②對照品溶液：再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。③黃連陰性對照品溶液：再取缺黃連藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)［4］，吸取供試品溶液5 μL、陰性對照品溶液5 μL、對照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。⑤結(jié)果：供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)；陰性對照色譜中，無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為黃連的鑒別。

圖1 黃連薄層鑒別圖譜

2.1.2 蒲公英的鑒別［5］①供試品溶液：取本品10 g，研細(xì)，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。②對照藥材溶液：另取蒲公英對照藥材1 g，加甲醇20 mL，同法制得對照藥材溶液。③蒲公英陰性對照品溶液：再取缺蒲公英藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)［4］，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各10～15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。⑤結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；陰性對照色譜中，無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為蒲公英的鑒別。如圖2所示。

圖2 蒲公英薄層鑒別圖譜

2.1.3 薏苡仁的鑒別［6］①供試品溶液：取本品10 g，研細(xì)，加石油醚（60～90 ℃）20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)邮兔? mL使溶解，作為供試品溶液。②對照藥材溶液：另取薏苡仁對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。③薏苡仁陰性對照品溶液：再取缺薏苡仁藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)［4］，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-醋酸（10∶3∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。⑤結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；陰性對照色譜中，無上述斑點(diǎn)檢出。說明本法專屬性強(qiáng)，可以作為薏苡仁的鑒別。

圖3 薏苡仁薄層鑒別圖譜

2.2 復(fù)方蒲公英顆粒檢查

2.2.1 水分 按照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法測定，取同一批復(fù)方蒲公英顆粒，平行3份，測得平均含水量為4.32 %（小于8.0 %），符合要求。

2.2.2 溶化性 按照《中國藥典》2015年版四部通則0104顆粒劑溶化性項(xiàng)下規(guī)定，取復(fù)方蒲公英顆粒10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，觀察到顆粒全部溶化，符合要求。

2.2.3 粒度 按照《中國藥典》2015年版四部通則0982粒度和粒度分布測定法第二法雙篩分法測定，結(jié)果不能通過一號篩與能通過五號篩的顆?？偤蜑?.0 g（不超過15 %）。

2.2.4 裝量差異 按照《中國藥典》2015年版四部通則0104顆粒劑裝量差異項(xiàng)下規(guī)定（6.0 g以上，裝量差異限度為±5 %），復(fù)方蒲連顆粒三批樣品裝量差異檢測結(jié)果均在±5 %范圍內(nèi)，符合藥典項(xiàng)下規(guī)定。

2.2.5 微生物的檢查方法驗(yàn)證 根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)需求，從需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)法、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)法和控制菌檢查方法三個(gè)方面對復(fù)方蒲連顆粒微生物檢查方法進(jìn)行了詳細(xì)具體的驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果均符合要求，證明了復(fù)方蒲連顆粒微生物檢查方法是合理有效的，所獲得的檢驗(yàn)結(jié)果也是真實(shí)可靠的。

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件［4］色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相；檢測波長為345 nm；進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，供試品中的鹽酸小檗堿與其他成分有較好的分離度，陰性樣品對指標(biāo)成分含量測定無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.3.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL約含20 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇：鹽酸（100∶1）混合溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過（0.45 μm濾膜），取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，稱取缺少黃連的復(fù)方蒲公英顆粒的藥材，按照制備工藝配制，然后依照“2.3.3”項(xiàng)下的方法制備陰性對照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品33.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.66 mg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液，分別進(jìn)樣20 μL，以測定濃度X（mg/mL）對峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=4×107X-50 694，r=0.999 6（n=7），試驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.003 42～0.068 40 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取鹽酸小檗堿對照品溶液（20 μg/mL）20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果對照品峰面積RSD=1.66 %，精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品同一批號樣品6份，按2.3.3項(xiàng)下方法操作，分別按上述色譜條件方法進(jìn)行測定鹽酸小檗堿，計(jì)算樣品含量，RSD為2.20 %（n=6），表明該含量測定方法有良好的重復(fù)性。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號樣品溶液（170504），室溫放置，在0、2、4、6、8、12、24 h分別精密吸取20 μL測定，按上述色譜條件測定結(jié)果峰面積的RSD為1.26 %。色譜峰面積在24 h內(nèi)基本無變化，說明穩(wěn)定性好。

2.3.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批號（170504）樣品6份，研碎，分別加入鹽酸小檗堿對照品溶液（0.142 0 mg/mL）1 mL，按上述2.3.3項(xiàng)下制備方法配制加樣回收供試液，按上述色譜條件測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.10 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算3批中試樣品（170504、170505、170506）含量。

表2 三批樣品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 專屬性 本試驗(yàn)對處方中的黃連、桑白皮、大黃、蒲公英、薏苡仁、茵陳等進(jìn)行了薄層鑒別條件摸索，發(fā)現(xiàn)桑白皮、大黃、茵陳等均有陰性干擾，因此確定了黃連、蒲公英和薏苡仁作為薄層鑒別方法，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。同時(shí)參考中國藥典2015年版一部收載的黃連中鹽酸小檗堿含量測定方法，通過方法學(xué)驗(yàn)證，確定了本品的含量測定方法，方法簡便，穩(wěn)定，快捷，且所測3批樣品中鹽酸小檗堿的含量穩(wěn)定，方法可行。

3.2 提取方法的選擇 對加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行了摸索及確定，進(jìn)行了三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，提取次數(shù)對提取工藝影響最大，其次是加水量，提取時(shí)間對提取工藝影響較小。從經(jīng)濟(jì)成本、實(shí)際生產(chǎn)考慮，確定本品提取最佳工藝條件為：加水量為8倍，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為2次。

3.3 濃縮工藝考察 日常生產(chǎn)過程中，我們考察濾液濃縮的相對密度對制劑成型工藝的影響，通過將制粒過程及顆粒的性狀作為參考指標(biāo)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)濾液濃縮的相對密度為1.35最適宜，考慮到實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，將濾液濃縮的相對密度定為1.32～1.35（60 ℃）的稠膏。

3.4 制劑工藝的選擇 日常生產(chǎn)過程中，中藥顆粒劑一般采用蔗糖作為矯味劑，糊精、淀粉作為粘合劑，我們分別對其進(jìn)行了考察，并以溶化性作為參考依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖加糊精，溶化完全，無分層現(xiàn)象；蔗糖加淀粉，溶化性不好，出現(xiàn)少量分層現(xiàn)象。故根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用蔗糖、糊精作為制劑成型輔料。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入蔗糖與糊精比例為2∶3，軟材適中，顆粒均勻。由于實(shí)際生產(chǎn)過程中藥材批次不同，出膏率不一樣，可進(jìn)行適當(dāng)微調(diào)。

3.5 干燥工藝的選擇 日常生產(chǎn)過程中，我們考察干燥工藝對制劑成型工藝的影響，通過將不同干燥溫度與干燥時(shí)間來測定水分作為參考指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定（8.0 %＜水分），根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，將干燥溫度定為60～80 ℃，干燥時(shí)間定為2～4 h，考慮到生產(chǎn)批量不同，可適當(dāng)微調(diào)。

3.6 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器對鹽酸小檗堿對照品色譜峰進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果鹽酸小檗堿在345 nm波長處有最大吸收，由于345 nm雜峰對目標(biāo)峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇345 nm作為檢測波長。

3.7 色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)通過摸索乙腈-0.05 mol/L磷酸水溶液、甲醇-0.05 mol/L磷酸水溶液按一定比例混合作為流動相，考察其分離度，結(jié)果以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相；檢測波長為345 nm，Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜條件下供試品中鹽酸小檗堿與其他共存組分峰能達(dá)到良好的分離。

本實(shí)驗(yàn)建立了復(fù)方蒲公英顆粒中鹽酸小檗堿的HPLC含量測定方法。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好。