蛇傷外敷超微散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

★ 劉水婷 朱衛(wèi)豐* 李佳莉 沈安 王萬(wàn)春（.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院外一科 南昌 330006）

中醫(yī)治療毒蛇咬傷常采用中藥外敷，中藥外敷能夠直接作用于病所，達(dá)到解毒、消腫、止痛的作用［1］。蛇傷外敷散（由七葉一枝花、半邊蓮、枯礬、芒硝、黃柏、制天南星、白芷、川芎、五靈脂等藥材組成）是江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的經(jīng)驗(yàn)方。具有解毒化瘀、消腫止痛的功效，臨床上用于輔助治療蛇毒咬傷所致的“風(fēng)、火二毒”［2］。經(jīng)多年臨床證實(shí)，此經(jīng)驗(yàn)方療效顯著，但在臨床使用中患者反映散劑顆粒粗大，且具有灼燒感，于是臨床提出對(duì)劑型進(jìn)行改良，研制出蛇傷外敷超微散劑。為了更全面地對(duì)蛇傷外敷超微散劑內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究采用薄層色譜法、顯微鑒別法等對(duì)處方中相關(guān)藥物進(jìn)行定性鑒別，同時(shí)采用HPLC法測(cè)定制劑中黃柏的有效成分鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量。以期為該方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 EPED實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；KQ-500VDE數(shù)控超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；BP211D Sartorius 電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；振動(dòng)式藥物超微粉碎機(jī)（WZJ-6BI型 濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司）；西廚多功能粉碎機(jī)（800Y型 永康市鉑歐五金制品有限公司）；藥典篩三號(hào)篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）；真空干燥箱（OZF-6050型 上海新苗醫(yī)療機(jī)械制造有限公司）。

1.2 試藥 重樓（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：161116）；醋炒五靈脂（產(chǎn)地：湖北，批號(hào)：161214，）；川芎（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：170208）；白芷（產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：161110）；芒硝（批號(hào)：170221）；半邊蓮（產(chǎn)地：江蘇，批號(hào)：170112）；制天南星（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：160324），以上均購(gòu)自江西江中中藥飲片有限公司；枯礬（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：1506062，四川新荷花中藥飲片股份有限公司）；黃柏（產(chǎn)地：四川，批號(hào)：180801，江西繼中堂健康科技有限公司）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-2001212）、鹽酸黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)：111895-201504）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純；自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別［3］

2.1.1 蛇傷外敷超微散中重樓的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散2.0 g，加入乙醇10 mL，加熱回流提取30 min，濾過，濾液作為供試品溶液，同法制備陰性對(duì)照。另取重樓對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各7 μL及（含量測(cè)定）項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（15∶5∶1）為展開劑，展開，待晾干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱顯色，置日光或365 nm紫外燈下檢視。結(jié)果見圖1.1和1.2。

圖1.1 日光下重樓薄層色譜圖

圖1.2 365nm重樓薄層色譜圖

2.1.2 蛇傷外敷超微散中川芎的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散5.0 g，加入乙醚20 mL，加熱回流提取1 h，濾過，濾液揮干后，加乙酸乙酯2 mL使溶解殘?jiān)?，作為供試品溶液。同法制備陰性?duì)照。另取川芎對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液10 μL及對(duì)照藥材溶液各11 μL，分別點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，待晾干后，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果見圖2。

圖2 川芎薄層色譜圖

2.1.3 蛇傷外敷超微散中白芷的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散6.0 g，加乙醚提取兩次，10 mL/次，合并提取液，揮干乙醚，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照。 取歐前胡素、異歐前胡素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。另取白芷對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液，對(duì)照藥材各6 μL及對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以石油醚-乙醚（1∶1）為展開劑，展開，待晾干后，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果見圖3。

圖3 白芷薄層色譜圖

2.1.4 蛇傷外敷超微散中半邊蓮的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散5.0 g，加氯仿50 mL，超聲處理半小時(shí)，濾過，濾液置水浴上蒸干，加甲醇1 mL使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照。另取半邊蓮對(duì)照藥材1.0 g ，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60）-醋酸乙酯（5∶1）為展開劑，展開，待晾干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖4。

圖4 半邊蓮薄層色譜圖

2.1.5 蛇傷外敷超微散中制天南星的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散5.0 g，加乙醇50 mL，加熱回流1.5 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL乙醚超聲處理5 min，濾過，殘?jiān)儆靡颐阎貜?fù)處理2次，合并三次乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照。另取干姜對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各6 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，環(huán)己烷-乙醚-丙酮-冰醋酸（40∶10∶5∶0.5）為展開劑，展開，晾干后，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖5。

圖5 制天南星薄層色譜圖

2.1.6 蛇傷外敷超微散中黃柏的TLC鑒別 取蛇傷外敷超微散3.0 g，加乙醚40 mL，超聲處理15 min，濾過，保留藥渣并揮盡乙醚，藥渣加入50 mL甲醇，加熱回流30 min，濾過、濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇25 mL，加熱回流30 min，濾過、濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各4 μL，分別點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑［4］，展開，晾干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果見圖6。

圖6 黃柏薄層色譜圖

2.2 顯微鑒別 取本品粉末少量，置載玻片上，攤平，加 1 滴水合氯醛，透化處理后，在顯微鏡下觀察，在高倍鏡下拍照。

2.2.1 蛇傷外敷超微散中重樓的顯微鑒別 草酸鈣針晶粗大，成束或散在，長(zhǎng)80～250 μm［5］。見圖7.1和圖7.2。

圖7.1 重樓草酸鈣大針晶成束（×400）

圖7.2 重樓草酸鈣大針晶散在（×400）

2.2.2 蛇傷外敷超微散中制天南星的顯微鑒別 草酸鈣針晶較細(xì)，成束，長(zhǎng)6～35μm［5］。見圖8。

圖8 制天南星草酸鈣針晶成束（×400）

2.2.3 蛇傷外敷超微散中黃柏的顯微鑒別 纖維呈鮮黃色，直徑為16～38 μm，常成束，常形成晶纖維。石細(xì)胞呈樹突狀［6］。見圖9.1和9.2。

圖9.1 黃柏晶纖維圖（×400）

圖9.2 黃柏樹突狀石細(xì)胞圖（×400）

2.2.4 蛇傷外敷超微散中川芎的顯微鑒別 多數(shù)油室可見破損，偶爾可見油室的碎片，內(nèi)含油滴較多。見圖10。

圖10 川芎油滴圖（×400）

2.2.5 蛇傷外敷超微散中白芷的顯微鑒別 木栓細(xì)胞多角形或類長(zhǎng)方形，淡黃棕色。內(nèi)含油管且多已破碎成管狀，內(nèi)含滴狀或塊狀黃棕色分泌物［7］。見圖11。

圖11 白芷油管圖（×400）

2.3 蛇傷外敷超微散粒徑 取適量的蛇傷外敷超微散，用馬爾文激光粒度儀測(cè)其粒徑（size），測(cè)定三批樣品 ，粒徑數(shù)據(jù)見表1和圖12。

表1 蛇傷外敷超微散粒徑 μm

圖12 蛇傷外敷超微散粒徑分布圖

2.4 蛇傷外敷超微散中黃柏含量測(cè)定

2.4.1 黃柏中小檗堿的含量測(cè)定

2.4.1.1 色譜條件 色譜條件：菲羅門C18-色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g），流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm，進(jìn)樣5 μL。

2.4.1.2 專屬性考察 黃柏中鹽酸小檗堿的專屬性試驗(yàn)結(jié)果見圖13。

圖13 鹽酸小檗堿的HPLC圖

2.4.1.3 線性關(guān)系考察 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定鹽酸小檗堿5 mg，加入至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容。

母液的濃度鹽酸小檗堿503.5 μg/mL，依次稀釋 至251.75、125.88、62.94、31.47、15.74、7.87 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按“2.4.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，峰面積分值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示小檗堿的線性方程為：Y=9.434 8X+ 44.62，r=0.999 6，鹽酸小檗堿在7.87～503.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.1.4 精密度考察 精密吸取上述同一對(duì)照品溶液5 μL，按“2.4.1.1”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算出濃度，結(jié)果鹽酸小檗堿的濃度值RSD為0.17%，表明精密度良好。

2.4.1.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算濃度RSD為0.85%。試驗(yàn)表明24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4.1.6 重復(fù)性考察 按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一批樣品，同時(shí)取樣6份，分別制備供試品溶液，按“2.4.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算的濃度RSD為0.73%，重現(xiàn)性良好。

2.4.1.7 加樣回收率 取已知含量的樣品六份，分別加入同一對(duì)照品溶液，混合均勻后，過0.22 μm為微孔濾膜后，按“2.4.1.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1.8 含量測(cè)定 取蛇傷外敷超微散粉末（過三號(hào)篩）約1.2 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相80 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz） 40 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果見表3。

表3 鹽酸小檗堿含量測(cè)定結(jié)果

2.4.2 黃柏中黃柏堿的含量測(cè)定

2.4.2.1 色譜條件 色譜條件：菲羅門C18-色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.2 g）為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm，進(jìn)樣5 μL。

2.4.1.2 專屬性考察 黃柏中鹽酸黃柏堿的專屬性試驗(yàn)結(jié)果見圖14。

圖14 鹽酸黃柏堿的HPLC圖

2.4.2.3 線性關(guān)系考察 對(duì)照品溶液的制備：精密稱定鹽酸黃柏堿10 mg，加入至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容。

母液的濃度鹽酸黃柏堿503.5μg/mL，依次稀釋 至506.5、253.25、126.63、101.3、63.31、31.66、15.83、7.90 μg/mL的鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按“2.4.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，峰面積分值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示鹽酸黃柏堿的線性方程為：Y=5.456 3X+ 1.453 1，r=0.999 8，鹽酸黃柏堿在7.90～1 013 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2.4 精密度考察 精密吸取上述同一對(duì)照品溶液5 μL，按“2.4.2.1”項(xiàng)下方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算出濃度，結(jié)果鹽酸黃柏堿的濃度值RSD為0.34%，表明精密度良好。

2.4.2.5 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算濃度RSD為1.46%。試驗(yàn)表明24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4.2.6 重復(fù)性考察 按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一批樣品，同時(shí)取樣6份，分別制備供試品溶液，按“2.4.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算的濃度RSD為0.93%，重現(xiàn)性良好。

2.4.2.7 加樣回收率 取已知含量的樣品六份，分別加入同一鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液，混合均勻后，過0.22 μm為微孔濾膜后，按“2.4.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4。

表4 鹽酸黃柏堿回收率結(jié)果

2.4.2.8 含量測(cè)定 取蛇傷外敷超微散粉末3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動(dòng)相25 mL，稱重超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果見表5。

表5 鹽酸黃柏堿含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究采用TLC對(duì)蛇傷外敷超微散中重樓、半邊蓮、黃柏等藥材進(jìn)行了鑒定。在黃柏的薄層鑒別中，曾使用過苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-濃氨試液（12∶6∶3∶3∶1）作展開劑，但出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，特征斑點(diǎn)不明顯。通過多次試驗(yàn)， 篩選出以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑［4］，分離效果好，所得斑點(diǎn)清晰明顯。采用顯微鑒別法對(duì)處方中重樓、制天南星等藥材進(jìn)行鑒定，觀察的顯微結(jié)構(gòu)較為清晰。HPLC法對(duì)小檗堿和黃柏堿進(jìn)行含量測(cè)定，多批次的測(cè)定結(jié)果有較好的重復(fù)性。為蛇傷外敷超微散制訂相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，能為其安全使用提供保障［8］，也為臨床研究提供更加可靠的資料，并且可以對(duì)未來(lái)研究該處方新的劑型、新的工藝等提供參考。