miR-1-3p通過靶向調(diào)控CDK9對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響①

黃尚校 李春君 黃劍鋒 黃昌杰

(南寧市第二人民醫(yī)院放療科，南寧530031)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的最重要原因，也是目前我國發(fā)病率和死亡率同時位居第一的惡性腫瘤[1]。肺癌按照病理特征可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)，其中NSCLC最為常見，約占80%。大多數(shù)NSCLC患者確診即晚期，且晚期NSCLC的5年總生存率不超過18%[2]。探索NSCLC發(fā)病機(jī)制以及尋找新的潛在治療靶點(diǎn)對于NSCLC治療和提高其5年總生存率具有重要意義。miRNA是一類長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因3′-UTR結(jié)合導(dǎo)致靶基因蛋白翻譯抑制或mRNA降解，在癌癥進(jìn)展中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用[3]。研究顯示，miR-1-3p在前列腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)，且具有明顯的抗癌作用[4-7]。同時，既往研究表明，在肺腺癌組織中miR-1-3p表達(dá)量顯著低于癌旁組織，且miR-1-3p過表達(dá)可顯著抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移及體外移植腫瘤生長[8]。但miR-1-3p在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確。此外，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶9(cyclin-dependent kinase 9，CDK9)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞周期控制及細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，是已知的重要癌癥治療靶點(diǎn)，包括NSCLC[9]。研究表明，抑制CDK9活性可抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有明顯抗腫瘤作用[10，11]。雖然生物信息學(xué)軟件(TargetScan)預(yù)測miR-1-3p與CDK9基因存在互補(bǔ)序列，但miR-1-3p是否通過靶向調(diào)控CDK9表達(dá)影響NSCLC發(fā)展尚未見報道。因此，本研究擬分析NSCLC細(xì)胞系中miR-1-3p與CDK9蛋白表達(dá)水平，通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C二者靶向調(diào)控關(guān)系，探討miR-1-3p是否通過靶向調(diào)控CDK9表達(dá)影響NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡，為NSCLC的靶向治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與主要試劑 人肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B及人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H1299、HCC827、H460均購自美國ATCC公司；miR-1-3p和U6引物、miR-1-3p mimic及其陰性對照(miR-NC)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；pCEP4-CDK9質(zhì)粒由吉滿生物科技(上海)有限公司提供；BEGM、F-12K和RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Lonza公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Hairpin-itTMmiRNA qPCR Quantitation Kit購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Dual-Luciferase? Reporter Assay System購自美國Promega公司；Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒和CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人CDK9單克隆抗體、兔抗人cleaved-Caspase-3多克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國CST公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B及4種人NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827、H460，并于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，BEAS-2B采用BEGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，A549細(xì)胞采用F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng)，H1299、HCC827和H460細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。復(fù)蘇后的細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)，2 d后傳代1次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，以3×105個/孔接種于6孔板培養(yǎng)18 h。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，采用Lipofectamine 3000將miR-1-3p mimic及其陰性對照(miR-NC)或CDK9過表達(dá)質(zhì)粒(pCEP4-CDK9)分別或同時轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞，選擇未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞作為空白對照(blank)，4 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3qPCR檢測細(xì)胞miR-1-3p表達(dá) 收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞沉淀，TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以U6為內(nèi)參，qPCR反應(yīng)檢測miR-1-3p表達(dá)。引物序列為：miR-1-3p F：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，R：5′-GGCCTGGAATGTAAAGAAGT-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGC-ACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)，72℃延伸7 min。2-ΔΔCt法計算miR-1-3p相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.4熒光素酶報告實驗驗證miR-1-3p與CDK9基因的靶向關(guān)系 TargetScan miRNAs生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-1-3p在CDK9 mRNA上的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建CDK9-3′UTR野生型(WT)和突變型(MUT)報告基因質(zhì)粒，并分別與miR-1-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Dual-Luciferase? Reporter Assay System說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值表示熒光素酶相對活性。實驗重復(fù)3次。

1.2.5CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×103個/μl，接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，miR-1-3p mimic和pCEP4-CDK9分別或同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，置于37℃、5% CO2中分別培養(yǎng)0、24、48、72 h。各培養(yǎng)時間結(jié)束前1 h，10 μl/孔加入CCK-8溶液，37℃避光孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.2.6平板克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液并計數(shù)，200個/孔接種于6孔板，設(shè)3個復(fù)孔，并使細(xì)胞分散均勻。定時觀察細(xì)胞克隆形成情況，出現(xiàn)肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，Giemsa染色30 min，菌落計數(shù)法肉眼直接觀察克隆形成數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.7Annexin-V FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的各組轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，1.2×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個/μl，取1 ml細(xì)胞懸液分別加入5 μl Annexin-V FITC和PI 充分混合，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.2.8Western blot法檢測細(xì)胞CDK9及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組A549細(xì)胞沉淀，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 g離心20 min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBS洗滌后加入一抗，CDK9抗體(1∶1 000)、cleaved-Caspase-3抗體(1∶1 000)、Bax抗體(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜，PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶10 000)二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，ECL顯影，Image J分析條帶灰度值。重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1miR-1-3p和CDK9在NSCLC細(xì)胞的表達(dá) qPCR實驗結(jié)果顯示，與人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B相比，人NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827和H460細(xì)胞中miR-1-3p表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05，圖1A)，其中A549細(xì)胞降低最為顯著；Western blot實驗結(jié)果顯示，與肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B細(xì)胞相比，NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827和H460細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05，圖1B)，A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)上升最為顯著。提示miR-1-3p與CDK9間可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，選擇A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2miR-1-3p抑制A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá) miR-1-3p mimic轉(zhuǎn)染至人NSCLC A549細(xì)胞后，qPCR實驗結(jié)果顯示，與blank組和miR-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimic可顯著提高A549細(xì)胞中miR-1-3p表達(dá)(P<0.01，圖2A)。Western blot結(jié)果顯示，與blank組和miR-NC組相比，miR-1-3p 過表達(dá)可顯著下調(diào)A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)(P<0.01，圖2B)。提示CDK9可能是miR-1-3p的靶基因。

2.3miR-1-3p靶向負(fù)調(diào)控CDK9 生物信息學(xué)軟件TargetScan預(yù)測結(jié)果顯示，CDK9基因與miR-1-3p堿基序列存在部分互補(bǔ)。熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步證實，miR-1-3p mimic可顯著降低野生型CDK9報告基因的熒光素酶活性(P<0.05)，而對突變型CDK9報告基因熒光素酶的活性影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)。表明CDK9是miR-1-3p的靶基因。

圖1 NSCLC細(xì)胞中miR-1-3p和CDK9蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression of miR-1-3p and CDK9 protein in NSCLC cell linesNote:Compared with BEAS-2B cells，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖2 miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of miR-1-3p overexpression on protein expression level of CDK9 in A549 cellsNote:Compared with blank or miR-NC group，**.P<0.01.

2.4miR-1-3p過表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖 Western blot結(jié)果顯示，與blank組相比，過表達(dá)CDK9可顯著提高A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，與miR-1-3p mimic組相比，miR-1-3p mimic與pCEP4-CDK9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞中CDK9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，表明CDK9過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，見圖4。CCK-8實驗和平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，與blank組相比，轉(zhuǎn)染48 h后miR-1-3p mimic組細(xì)胞增殖和克隆形成能力均顯著降低(P<0.05)，而pCEP4-CDK9組細(xì)胞增殖和克隆形成能力則顯著提高(P<0.05)。與miR-1-3p mimic組相比，mimic+pCEP4-CDK9組細(xì)胞增殖和克隆形成能力顯著提高(P<0.05)，見圖5。表明miR-1-3p通過靶向抑制CDK9表達(dá)而抑制A549細(xì)胞增殖。

2.5miR-1-3p過表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡 與blank組相比，miR-1-3pmimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，pCEP4-CDK9組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與miR-1-3pmimic組相比，mimic+pCEP4-CDK9組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖6。Western blot結(jié)果顯示，與blank組相比，miR-1-3pmimic組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而pCEP4-CDK9組細(xì)胞cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。而與miR-1-3pmimic組相比，mimic+pCEP4-CDK9組細(xì)胞中cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖7。表明miR-1-3p可通過靶向抑制CDK9表達(dá)而促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

圖3 miR-1-3p與CDK9的靶向關(guān)系Fig.3 Target relationship between miR-1-3p and CDK9Note:Compared with miR-NC group，*.P<0.05.

圖4 轉(zhuǎn)染pCEP4-CDK9過表達(dá)質(zhì)粒后A549細(xì)胞中CDK9蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Expression level of CDK9 protein in A549 cells after transfection with pCEP4-CDK9 over expressed plasmidNote:Compared with blank group，**.P<0.01；compared with miR-1-3p mimic group，##.P<0.01.

圖5 miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of miR-1-3p overexpression on proliferation ability of A549 cellsNote:Compared with blank group，*.P<0.05;compared with miR-1-3p mimic group，#.P<0.05.

圖6 miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-1-3p overexpression on apoptosis of A549 cellsNote:Compared with blank group，*.P<0.05,**.P<0.01;compared with miR-1-3p mimic group，##.P<0.01.

圖7 miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of miR-1-3p overexpression on expressions of apoptosis-related proteins in A549 cellsNote:Compared with blank group，*.P<0.05,**.P<0.01;compared with miR-1-3p mimic group，##.P<0.01.

3 討論

miRNAs作為致癌或抑癌基因通過調(diào)控不同的靶基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。多種miRNAs與NSCLC預(yù)后及發(fā)展進(jìn)程相關(guān)，包括miR-34b、miR-21、miR-520b、miR-107及miR-1等[12-16]。miR-1是一種肌肉特異性miRNA，在骨骼肌分化中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)miR-1-3p對肺腺癌細(xì)胞生長、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為具有抑制作用，但具體作用機(jī)制尚未明確[8]。本研究顯示，在NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827和H460中miR-1-3p呈低表達(dá)，CDK9蛋白呈高表達(dá)，進(jìn)一步證實CDK9為miR-1-3p的靶基因，過表達(dá)miR-1-3p可抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，但CDK9過表達(dá)可抑制miR-1-3p對A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響。提示miR-1-3p通過靶向抑制CDK9表達(dá)抑制A549細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡。因此，miR-1-3p可能是治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。

hsa-miR-1-3p是hsa-miR-1的成熟體，在心肌、骨骼肌、肺、膀胱、前列腺等組織中均有表達(dá)，參與細(xì)胞生長、分化、凋亡及心臟發(fā)育等生理過程，且與腫瘤等疾病發(fā)生有關(guān)[17]。研究表明，miR-1-3p在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并發(fā)揮抑癌基因作用。Li等[4]研究顯示，miR-1-3p在晚期前列腺癌組織及細(xì)胞系中低表達(dá)并與患者不良預(yù)后相關(guān)，過表達(dá)miR-1-3p可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其細(xì)胞周期阻滯。Gao等[6]報道m(xù)iR-1-3p在膀胱癌組織和細(xì)胞系低表達(dá)，過表達(dá)miR-1-3p可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。miR-1-3p在NSCLC組織中低表達(dá)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[8，16]。因此，miR-1-3p在NSCLC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中可能起抑癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，miR-1-3p在NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827和H460中呈低表達(dá)，在A549細(xì)胞中降低最為顯著。本研究miR-1-3p在NSCLC細(xì)胞水平上的表達(dá)結(jié)果與既往報道的miR-1-3p在NSCLC組織中表達(dá)的結(jié)果相符，表明miR-1-3p可能在NSCLC中發(fā)揮抑癌基因作用。為進(jìn)一步證實miR-1-3p在NSCLC細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimic至A549細(xì)胞，探討miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，miR-1-3p過表達(dá)可顯著抑制A549細(xì)胞增殖和克隆形成能力，并通過顯著上調(diào)cleaved-Caspase-3和Bax表達(dá)以及下調(diào)Bcl-2表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡，表明miR-1-3p過表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示miR-1-3p在NSCLC細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因作用。

miRNA主要通過與靶基因3′-UTR結(jié)合導(dǎo)致靶基因mRNA降解或阻止其翻譯而發(fā)揮作用。miR-1-3p的潛在靶基因眾多，其中CDK9是一種cdc2樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用，是目前公認(rèn)的治療癌癥的重要靶點(diǎn)[9]。既往研究顯示，多種miRANs通過靶向抑制CDK9表達(dá)發(fā)揮抑癌基因作用[18-20]。本研究顯示，與人肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B相比，CDK9蛋白在NSCLC細(xì)胞株A549、H1299、HCC827、H460中均顯著上調(diào)，與miR-1-3p相反，提示miR-1-3p極有可能通過靶向負(fù)調(diào)控CDK9表達(dá)參與調(diào)控A549細(xì)胞的增殖與凋亡。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)軟件TargetScan進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示CDK9基因與miR-1-3p堿基序列存在部分互補(bǔ)，過表達(dá)miR-1-3p可顯著抑制CDK9蛋白表達(dá)，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步證實CDK9是miR-1-3p的靶基因。為進(jìn)一步證明miR-1-3p通過靶向CDK9參與A549細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控過程，本研究將miR-1-3p mimic和CDK9過表達(dá)質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，結(jié)果顯示CDK9過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miR-1-3p過表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡的促進(jìn)作用，證實miR-1-3p通過靶向抑制CDK9表達(dá)而抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，miR-1-3p在NSCLC細(xì)胞株中低表達(dá)，過表達(dá)miR-1-3p可抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，作用機(jī)制可能是通過靶向抑制CDK9表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究對miR-1-3p調(diào)控NSCLC發(fā)展的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，為NSCLC的靶向治療提供新的思路。