黃花倒水蓮下調(diào)miR-369對LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究

代 天 楊 萍 趙 謙 劉泰民 蔣 品 張?zhí)K川

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)心血管內(nèi)科，武漢430015)

內(nèi)毒素血癥由內(nèi)毒素感染引起，可導(dǎo)致致死性感染休克、多器官功能障礙或衰竭等，病死率極高[1]。心臟功能障礙是內(nèi)毒素血癥最常見的并發(fā)癥，研究表明約40%的內(nèi)毒素血癥患者出現(xiàn)可逆性心肌抑制，而合并心肌功能障礙的患者病死率高達(dá)50%[2,3]。因此尋找有效的藥物預(yù)防及治療內(nèi)毒素血癥所致的心肌損傷具有重要臨床意義。

黃花倒水蓮(Polygala fallax Hemsl，PFH)是遠(yuǎn)志科植物黃花倒水蓮的干燥根，具有良好的抗炎、抗病毒、抗氧化、抗應(yīng)激及改善心肌缺血等作用[4,5]。但PFH對心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制尚不明確。本研究以大鼠心肌細(xì)胞株為研究對象，體外探討PFH對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的作用及其潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1.1細(xì)胞來源 大鼠心肌細(xì)胞H9c2和CP-R073由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.1.2主要試劑 黃花倒水蓮(PFH，200 g，贛州市醫(yī)藥公司)；脂多糖(LPS，純度≥99%，Solarbio公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)；miR-369抑制物(miR-369-inhibitor)及陰性對照(inhibitor NC)、miR-369模擬物(miR-369-mimics)及陰性對照(mimics NC)、AKT1小干擾RNA(siRNA-AKT1)及陰性對照(siRNA-NC)(廣州銳博生物科技有限公司)；MTT試劑、DMSO(日本同仁生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Pierce Biotechnology公司)；TRIzol、RIPA裂解液(Invitrogen公司)；AKT1抗體(美國Millipore公司，貨號：02066000)；Bcl-2抗體、Bax抗體、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體(Sigma-Aldrich公司，貨號：ABC345、AB2915和AP183P)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 將H9c2和CP-R073細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)，加入1 ml胰酶消化細(xì)胞1 min，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液于離心管中，離心收集細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

收集對數(shù)生長期的心肌細(xì)胞，將細(xì)胞稀釋后以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞達(dá)60%左右融合時(shí)，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將inhibitor NC、miR-369-inhibitor、mimics NC、miR-369-mimics、siRNA-NC、siRNA-AKT1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，并分別記為anti-miR-NC組、anti-miR-369組、miR-NC組、miR-369組、si-NC組和si-AKT1組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2MTT實(shí)驗(yàn) 以10 μg/ml的LPS預(yù)處理H9c2細(xì)胞、CP-R073細(xì)胞，轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞12 h后，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，加入相應(yīng)濃度的PFH(1、3、5 g/kg)，將未做任何處理的心肌細(xì)胞作為對照組(Con組)，僅用LPS處理的心肌細(xì)胞作為LPS組。分別于培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)，加入MTT試劑20 μl培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μl振蕩反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀下測定各孔490 nm波長處吸光值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集上述PFH處理48 h后的各組細(xì)胞，稀釋至2×106個(gè)/ml轉(zhuǎn)移至流式管，離心收集細(xì)胞，PBS溶液沖洗2次。參照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書，將細(xì)胞重懸于200 μl 1×Binding Buffer，并先后加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI避光反應(yīng)。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4qRT-PCR TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，檢測提取RNA樣品的純度和完整性，將RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。分別選擇U6和GAPDH為內(nèi)參基因，以cDNA為模板，采用SYBR Green法進(jìn)行qPCR反應(yīng)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-369和AKT1 mRNA相對表達(dá)量。用引物序列：miR-369 F:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGG-CGAATAT-3′，R：5′-CTGGGAGATCGACCGTGTTAT-ATTCGC-3′；AKT1 F:5′-ATGAACGACGTAGCCATT-GTG-3′，R：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′；U6 F:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，R：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；GAPDH F:5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′,R：5′-AGCCC-AGGATGCCCTTTAGT-3′。

漏電保護(hù)器的裝設(shè)場所；由于人手握住手持式或移動(dòng)式電器時(shí)，如果該電器漏電，則人手因觸電痙攣而很難擺脫，觸電時(shí)間一長，就會(huì)導(dǎo)致死亡，而固定式電器漏電，如人體觸及，會(huì)因電擊刺痛而彈離，一般不會(huì)繼續(xù)觸電.由此可見，手持式和移動(dòng)式電器觸電的危險(xiǎn)性遠(yuǎn)大于固定式電器觸電，因此一般規(guī)定，安裝手持式和移動(dòng)式電器的回路上應(yīng)裝設(shè) RCD.由于插座主要是用來連接手持式和移動(dòng)式電器的，因此插座式回路上也應(yīng)裝設(shè)RCD.GB50096-1999 《住宅設(shè)計(jì)規(guī)范》規(guī)定，除空調(diào)機(jī)電源插座外，其它電源插座回路均應(yīng)裝設(shè)RCD.

1.2.5Western blot 裂解法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定樣本蛋白濃度，將蛋白樣品放入提前預(yù)熱的100℃水浴鍋中變性5 min，取35 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉封閉1 h后加入稀釋后的蛋白一抗，4℃孵育過夜，洗膜4次，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。洗膜4次，加入ECL染色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)下曝光，應(yīng)用Image軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 為證實(shí)miR-369靶向AKT1基因，本研究將AKT1的3′UTR區(qū)和突變的3′UTR區(qū)構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體，并分別與miRNA-mimics陰性對照和miR-369-mimics轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后測定細(xì)胞中熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2、CP-R073增殖和凋亡的影響 與Con組相比，LPS組和LPS+PFH各劑量組H9c2和CP-R073細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)(表1)；LPS+PFH(3 g/kg)組H9c2和CP-R073細(xì)胞增殖抑制率明顯低于LPS組和LPS+PFH(1 g/kg)、PFH(5 g/kg)組(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)選擇對PFH敏感性相對較好的H9c2細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

與Con組相比，LPS組和LPS+PFH各劑量組H9c2細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)；與LPS組、LPS+PFH(1 g/kg)、(5 g/kg)組相比，LPS+PFH(3 g/kg)組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)(表2、圖1)。

圖1 PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響Fig.1 Effect of PFH on LPS-induced apoptosis of H9c2 in cardiomyocytesNote:1.Con；2.LPS;3.LPS+PFH(1 g/kg);4.LPS+PFH(3 g/kg)；5.LPS+PFH(5 g/kg).

表1 PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2、CP-R073增殖的影響

2.2PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-369、AKT1表達(dá)的影響 與Con組相比，LPS組心肌細(xì)胞中miR-369相對表達(dá)水平升高(P<0.05)，AKT1 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平降低(P<0.05)；與LPS組和LPS+PFH(1 g/kg)、(5 g/kg)組相比，LPS+PFH

表2 PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響

表3 PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2中 miR-369、AKT1表達(dá)的影響

圖2 AKT1蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of AKT1 proteinNote:1.Con;2.LPS;3.LPS+PFH(1 g/kg);4.LPS+PFH(3 g/kg);5.LPS+PFH(5 g/kg).

(3 g/kg)組細(xì)胞中miR-369表達(dá)水平降低(P<0.05)，AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。選擇對心肌細(xì)胞損傷保護(hù)較為有效的PFH濃度(3 g/kg)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表3、圖2。

2.3抑制miR-369表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2增殖、凋亡的影響 與LPS+anti-miR-NC組相比，LPS+anti-miR-369組心肌細(xì)胞中miR-369相對表達(dá)水平、心肌細(xì)胞增殖抑制率、Bax蛋白、心肌細(xì)胞凋亡率均降低，細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、圖3。

2.4過表達(dá)miR-369能逆轉(zhuǎn)PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2增殖和凋亡的影響 與LPS+PFH+miR-NC組比較，LPS+PFH+miR-369組心肌細(xì)胞中miR-369相對表達(dá)水平升高，細(xì)胞抑制率增加，細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5、圖4。

2.5miR-369靶向調(diào)控AKT1表達(dá) 生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)(圖5A)，miR-369能夠與AKT1的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果(表6)，過表達(dá)miR-369抑制心肌細(xì)胞中AKT1轉(zhuǎn)錄活性，而將AKT1的3′UTR區(qū)突變后抑制作用消失。Western blot結(jié)果表明(表7、圖5B)，過表達(dá)miR-369的心肌細(xì)胞中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，抑制表達(dá)miR-369的心肌細(xì)胞中AKT1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.6抑制AKT1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖和凋亡 與LPS+PFH+si-NC組相比，LPS+PFH+si-AKT1組心肌細(xì)胞中AKT1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表8、圖6。

圖3 抑制miR-369表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2凋亡的影響Fig.3 Effect of inhibition of miR-369 expression on apoptosis of H9c2 induced by LPS

表4 抑制miR-369表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞H9c2增殖、凋亡的影響

表5 過表達(dá)miR-369逆轉(zhuǎn)PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖4 凋亡蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of apoptotic proteinsNote:1.LPS;2.LPS+PFH;3.LPS+PFH+miR-NC;4.LPS+PFH+miR-369.

圖5 miR-369靶向調(diào)控AKT1的表達(dá)Fig.5 miR-369 targets regulation of AKT1 expressionNote:A.3′UTR of AKT1 contains complementary nucleotide sequence of miR-369;B.miR-369 regulates expression of AKT1.1.miR-NC;2.miR-369;3.anti-miR-NC;4.anti-miR-369.

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表7 miR-369對AKT1表達(dá)的影響

表8 抑制AKT1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)PTS對心肌細(xì)胞增殖、凋亡的作用

圖6 AKT1、凋亡蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of AKT1 and apoptotic proteinsNote:1.LPS;2.LPS+PFH;3.LPS+PFH+si-NC；4.LPS+PFH+si-AKT1.

3 討論

LPS又稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌的重要致病成分，可誘發(fā)內(nèi)毒素血癥，因此本研究利用LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞模擬內(nèi)毒素血癥時(shí)心肌細(xì)胞損傷，研究心肌損傷機(jī)制[6,7]。LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加是心肌功能障礙的主要原因之一[8,9]。本研究表明LPS可誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞增殖抑制，細(xì)胞中Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，細(xì)胞凋亡率增加，而用3 g/kg的PFH處理后心肌細(xì)胞增殖抑制率明顯降低，細(xì)胞中Bcl-2上調(diào)和Bax下調(diào)，細(xì)胞凋亡率降低，說明PFH能夠保護(hù)LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷。

miRNA是生物體內(nèi)一類內(nèi)源性非編碼小RNA，已被證實(shí)在心肌梗死、心肌纖維化、心肌肥大等心血管疾病中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，是心血管疾病預(yù)防及治療的潛在靶標(biāo)[10-12]。丁桃等[13]利用miRNA芯片技術(shù)證實(shí)LPS誘導(dǎo)心肌組織中miR-194-3p、miR-465-3p、miR-547-3p等多種miRNAs差異表達(dá)，提示miRNA與LPS誘導(dǎo)的心肌損傷有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞中miR-369表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-369表達(dá)后明顯降低了LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加，說明miR-369表達(dá)上調(diào)與LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PFH能夠降低LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-369的表達(dá)，而過表達(dá)miR-369逆轉(zhuǎn)了PFH對LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，提示PFH可能通過抑制miR-369表達(dá)發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

PI3K/AKT信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的重要通路之一[14]。Chen等[15]研究報(bào)道，紅景天甙可通過抑制體內(nèi)外活性氧(ROS)介導(dǎo)的PI3K/AKT/mTOR信號途徑，抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷。莊紅等[16]研究報(bào)道，過表達(dá)miR-182可通過激活PI3K/AKT信號通路促進(jìn)H2O2刺激的大鼠心肌細(xì)胞增殖并降低細(xì)胞凋亡率。提示PI3K/AKT信號通路與心肌細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-369能夠與AKT1的3′UTR區(qū)特異性結(jié)合，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)大鼠心肌細(xì)胞中miR-369靶向負(fù)調(diào)控AKT1的轉(zhuǎn)錄活性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抑制AKT1表達(dá)能逆轉(zhuǎn)PFH對LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。推測PFH可能通過下調(diào)miR-369，進(jìn)而靶向激活A(yù)KT信號通路，發(fā)揮對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，PFH能抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞中miR-369表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2上調(diào)和凋亡蛋白Bax下調(diào)，并靶向促進(jìn)AKT1表達(dá)，發(fā)揮對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明miR-369/AKT1途徑是PFH保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的分子可能分子機(jī)制之一，為PFH在心肌損傷的預(yù)防和治療中奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。