miR-25-3p通過靶向TLR4抑制糖尿病腎病炎癥反應

蔡 莉 孫 力 胡菊萍

(湖北省第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢430000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病微血管并發(fā)癥，1/3的糖尿病患者會并發(fā)DN，是引起糖尿病患者終末期腎病的主要原因。DN的發(fā)生涉及腎小球肥大、腎臟基底膜增厚、腎小球硬化以及間質(zhì)纖維化等多種病理改變，其分子發(fā)病機制較為復雜[1]。MicroRNA (miRNA)是一類非編碼長度為21～23個核苷酸的單鏈RNA片段，主要在翻譯水平調(diào)控基因表達，在細胞增殖、分化、細胞凋亡以及免疫應答等一系列生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用。目前已有文獻表明，多種miRNA在糖尿病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用[2]。Chen等[3]研究表明miR-21作為新型生物標志物用于DN診斷和治療。Liu等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病患者相比，糖尿病腎病患者血清中miR-25-3p表達水平降低，提示miR-25-3p可能是一個重要的DN調(diào)節(jié)因子。然而，miR-25-3p在DN中的具體作用如何目前未見相關報道。因此，本研究主要探討miR-25-3p在DN患者腎臟的表達、作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織 收集我院2015年1月～2019年1月期間50例DN患者的腎組織石蠟切片，入選患者經(jīng)腎活檢病理檢查確診為DN，對照組為同期保存的50例腎癌患者手術切除的腎臟病灶以遠的正常腎組織的石蠟切片。

1.1.2動物 4周齡SPF級正常小鼠(db/m小鼠)和糖尿病腎病模型小鼠(db/db小鼠)均購買于武漢大學動物實驗中心。

1.1.3主要試劑 293T細胞購于上?；馍锟萍加邢薰?；miR-25-3p原位雜交試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；RPMI1640基礎培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；miR-25-3p mimic、mimics NC、miR-25-3p agomir及agomir NC購于Biomics公司；脂質(zhì)體、TLR4、TNF-α、IL-1β、IL-6抗體及HRP標記二抗購于Thermo Fisher公司；TRIzol反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；LipofectamineTM2000購自美國Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1原位雜交 組織切片先脫蠟于37 ℃下蛋白酶K消化15 min，漂洗后梯度乙醇脫水，將切片置于41℃下預雜交4 h，洗去多余液體。地高辛標記miR-25-3p探針于4 ℃孵育過夜(miR-25-3p的專項探針序列為5′-TCAGACCGAGACAAGTGCAATG-3′)。次日，加封閉液封閉，之后依次滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC和生物素化過氧化物酶，漂洗后，DAB顯色，蘇木素復染封片，中性樹脂封片，鏡下觀察并獲得圖像。

1.2.2結果判定 miR-25-3p以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性，染色強度評分標準：0分為基本不著色、1分為淺黃色、2分為棕黃色、3分為棕褐色；陽性細胞占比評分標準為：0%記0分,1%～25%記1分，26%～50%記2分,51%～75%記3分, 76%～100%記4分。兩項指標評分乘積，判定結果如下：陰性為0～3分、4～6分為弱陽性、陽性為7～8分、強陽性為9～12分。

1.2.3雙熒光素酶實驗 構建野生型和突變型的TLR4-1 3′-UTR雙熒光報告質(zhì)粒。將對數(shù)生長期的293T細胞以1×105個/孔接種至12孔細胞板上，將TLR4-WT、TLR4-MUT與miR-25-3p mimics或mimics NC陰性對照按照LipofectamineTM2000說明書步驟轉(zhuǎn)染至293T細胞。每組實驗設置3個重復。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒步驟檢測熒光素酶活性。

1.2.4動物分組 4周齡SPF級糖尿病腎病模型小鼠隨機分為以下4組(每組20只小鼠)：①db/m小鼠為db/m組；②沒有進行尾靜脈注射db/db小鼠為db/db-untreated組；③每天尾部注射10 mg/kg agomir NC的db/db小鼠為db/db-miR-NC組；④每天尾部注射10 mg/kg尾靜脈注射miR-25-3p agomir的db/db小鼠為db/db-miR-25-3p組。連續(xù)注射4周后處死，具體的操作見參考文獻[5]。

1.2.5小鼠生化指標檢測 血液標本通過小鼠尾靜脈采血；尿液標本通過小鼠代謝籠收集24 h尿液，尿液標本和血液標本送我院檢驗科檢測。

1.2.6組織樣本的獲取 將小鼠麻醉后處死，快速剝離且縱剖雙腎，一部分組織快速凍存于液氮中，用于RNA和蛋白質(zhì)的提取。另一部分組織保存于多聚甲醛，包埋后用于HE染色。

1.2.7RT-qPCR檢測 采用TRIzol法提取各組組織的總RNA。再按照一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒檢測miR-25-3p和TLR4 mRNA的表達情況(引物見表1)，RT-qPCR反應體系和反應程序參照說明書。2-ΔΔCt的方法[6]進行相對定量分析，以U6和GAPDH為內(nèi)參。

1.2.8Western blot檢測 各組組織中分別加入RIPA裂解液并在冰上放置20 min，4 ℃ 13 000 r/min離心20 min，采用BCA試劑盒測定上清液中蛋白含量。取35 μg蛋白液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，用2%BSA封閉液封閉，分別加入一抗4 ℃過夜，以GAPDH抗體為參照，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL

表1 用于RT-qPCR的引物

曝光成像，采用Alpha Imager HP 凝膠成像系統(tǒng)分析結果。

1.2.9小鼠腎臟組織病理檢查 各組組織分別用40 g/L 多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，4 μm切片，HE染色后光鏡下觀察腎組織病理學變化。

1.3統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism5軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05(雙側)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1DN腎臟組織中的miR-25-3p表達情況 原位雜交檢測顯示，在DN腎臟組織中miR-25-3p的陽性率18%(9/50)明顯低于正常腎臟組織陽性率70%(35/50)，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=27.435，P<0.05)。見圖1。

2.2miR-25-3p靶向結合TLR4 應用生物信息學網(wǎng)站(Targetscan，miRanda等)預測TLR4與miR-25-3p的結合位點，序列見圖2A。野生型3′-UTR組中，與mimics NC組相比，miR-25-3p mimics組熒光素酶報告基因Renilla/Luciferase(R/L)值明顯降低(t=14.61，P<0.001)。但突變型3′-UTR組中，熒光素酶報告基因Renilla/Luciferase(R/L)值明顯降低無明顯變化(圖2B)。證明miR-25-3p靶向結合TLR4的3′-UTR。

圖1 各組腎臟中miR-25-3p原位雜交圖(×200)Fig.1 Situ hybridization chart of miR-25-3p in kidneys of each group(×200)

圖2 熒光素酶檢測R/L比值結果Fig.2 Results of luciferase detection of R/L ratioNote:***.P<0.001.

2.3miR-25-3p對db/db小鼠生化指標的影響 在注射前，各組db/db小鼠血糖明顯高于正常無疾病的db/m小鼠(P<0.001)，而db/db小鼠各組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在注射后，db/db-miR-25-3p組的血糖明顯低于db/db-miR-NC組和db/db-untreated組(P<0.001)，但仍明顯高于正常無疾病的db/m組(P<0.001)，見圖3。

如圖4所示，在注射前，各組db/db小鼠尿微量白蛋白明顯高于正常無疾病的db/m組小鼠(P<0.001)，而db/db小鼠各組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；在注射后，與db/db-miR-NC組和db/db-untreated組相比，db/db-miR-25-3p組的尿微量白蛋白明顯下降(P<0.001)，但仍明顯高于db/m組(P<0.001)。

2.4miR-25-3p抑制TLR4 mRNA的表達 miR-25-3p mRNA的表達情況：與db/m組相比，db/db-untreated組和db/db-miR-NC組腎皮質(zhì)組織中miR-25-3p mRNA相對表達水平明顯下降(P<0.001)；通過尾靜脈注射miR-25-3pagomir后，db/db-miR-25-3p組腎皮質(zhì)組織中的miR-25-3p mRNA表達量明顯高于db/db-miR-NC組和db/db-untreated組(P<0.05)。說明通過尾靜脈注射miR-25-3p agomir可以使miR-25-3p達到腎臟組織。

圖3 miR-25-3p對糖尿病腎病小鼠血糖的影響Fig.3 Effect of miR-25-3p on blood glucose in diabetic nephropathy miceNote:***.P<0.001.

圖4 miR-25-3p對糖尿病腎病小鼠尿微量白蛋白的影響Fig.4 Effect of miR-25-3p on urinary microalbumin in mice with diabetic nephropathyNote:***.P<0.001.

圖5 miR-25-3p對糖尿病腎病小鼠腎皮質(zhì)中TLR4 mRNA的相對表達水平Fig.5 Relative expression level of TLR4 mRNA in renal cortex of diabetic nephropathy mice by miR-25-3pNote:***.P<0.001.

圖6 各組TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達情況Fig.6 Expression of TLR4,TNF-α,IL-1β and IL-6 proteins in each groupNote:*.P<0.05.

TLR4 mRNA的表達情況：與db/m組相比，db/db-untreated組和db/db-miR-NC組腎皮質(zhì)組織中TLR4 mRNA相對表達水平明顯升高(P<0.001)；通過尾靜脈注射miR-25-3p agomir后，db/db-miR-25-3p組腎皮質(zhì)組織中的TLR4 mRNA表達量明顯低于db/db-miR-NC組和db/db-untreated組(P<0.001)。說明在腎臟部位過表達miR-25-3p會抑制TLR4 mRNA的表達。見圖5。

圖7 miR-25-3p對糖尿病腎病小鼠腎小球形態(tài)的影響(HE，×200)Fig.7 Effect of miR-25-3p on glomerular morphology of diabetic nephropathy mice (HE，×200)

2.5miR-25-3p抑制TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達 與正常db/m組相比，db/db-miR-NC組和db/db-untreated組腎皮質(zhì)組織中TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.05)；通過尾靜脈注射miR-25-3p agomir后，db/db-miR-25-3p組腎皮質(zhì)組織中的TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白表達量明顯低于db/db-untreated組和db/db-miR-NC組(P<0.05)。說明在腎臟部位過表達miR-25-3p會抑制TLR4、TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白的表達。見圖6。

2.6miR-25-3p對糖尿病腎病小鼠腎小球形態(tài)的影響 腎組織通過HE染色可以發(fā)現(xiàn)，與正常無疾病的db/m組相比，db/db-miR-NC組和db/db-untreated組情況類似，系膜細胞明顯增多，腎小球肥大現(xiàn)象明顯；在尾靜脈注射miR-25-3p agomir的db/db-miR-25-3p組中，系膜細胞增生不明顯，腎小球肥大的現(xiàn)象相對較弱，見圖7。

3 討論

在我國，DN的發(fā)病率和患病率逐年上升，對人民的生命健康造成嚴重威脅。DN的發(fā)病機制極為復雜，至今尚未完全闡明其發(fā)病。目前，許多研究證實了miRNA參與糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展[7]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-146a-5p、miR-10a-5p、miR-874、miR-192等在糖尿病腎病腎臟組織中高表達，而miR-26a-5p、miR-451和miR-155在糖尿病腎病腎臟組織中低表達[3,5,8,9]。其中，miR-21作用于PTEN基因誘導Akt激酶信號通路活化，進而導致腎纖維化蛋白一型膠原蛋白α2和黏連蛋白表達量增多和腎小球肥大[3]。miR-192通過靶向ZEB1/2基因激活TGF-β信號通路，從而導致腎纖維化蛋白Col1α2基因轉(zhuǎn)錄升高以及尿白蛋白水平升高[9]。

目前，miR-25-3p在膠質(zhì)瘤、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中高表達，促進腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲[10-12]。另外，miR-25-3p可與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)作共同參與多發(fā)性硬化的發(fā)病[13]。但miR-25-3p在DN腎組織中的表達及作用尚未見報道。本研究應用原位雜交檢測DN腎組織中miR-25-3p的表達，發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在DN腎組織中的表達與正常腎組織明顯降低，再結合Liu等[4]的研究結果，推測miR-25-3p可能參與DN的發(fā)病過程。

越來越多的證據(jù)表明炎癥在DN發(fā)病中具有關鍵作用[14]。TLR4是人類第一個被證實的Toll樣家族成員，在體內(nèi)與配體結合后可以激活信號通路，其中包括NF-κB通路和絲裂原激活的蛋白激酶家族通路，進而上調(diào)炎癥因子的表達，激活炎癥反應[15]。目前已有研究表明，TLR4及相關炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β在糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程中表達增加，說明TLR4信號通路激活與糖尿病腎病的發(fā)病機制關系密切[16，17]。本研究通過生物信息學網(wǎng)站預測到miR-25-3p可以與TLR4的3′-UTR區(qū)互補結合，并且應用雙熒光素酶實驗驗證了TLR4是miR-25-3p的直接靶點。而后在db/db小鼠中過表達miR-25-3p后，發(fā)現(xiàn)TLR4的表達下降，同時也發(fā)現(xiàn)促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平也降低，說明miR-25-3p與TLR4是一種負向的調(diào)節(jié)關系，miR-25-3p結合到TLR4 mRNA上的3′UTR來抑制TLR4的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進而抑制了促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的轉(zhuǎn)錄。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠過表達miR-25-3p后，可以明顯降低db/db小鼠尿微量白蛋白和血糖，改善糖尿病腎臟的炎癥損傷。這進一步證實了過表達miR-25-3p可以降低糖尿病腎病炎癥反應。

綜上所述，本研究僅在動物水平上初步揭示miR-25-3p通過靶向TLR4抑制糖尿病腎病炎癥反應，對糖尿病條件下的腎臟具有一定的保護作用。但miR-25-3p在糖尿病腎病患者中的具體機制，還需進一步的探究。