孤立性肺結(jié)節(jié)無創(chuàng)診斷的相關(guān)研究進(jìn)展

王春秀，徐麗新，王爽，李彩紅，石浩田，黃艷

(華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,河北 唐山)

0 引言

孤立性肺結(jié)節(jié)（solitary pulmonary nodule, SPN）定義為直徑最大為3cm 且被充氣肺完全包圍的單一的界限清楚的放射學(xué)不透明性的病灶，臨床表現(xiàn)常見胸水、病灶部肺不張以及肺門異常增大等[1]。孤立性肺結(jié)節(jié)性質(zhì)被分為兩種，一是癌性，即惡性；二是非癌性，即良性。其中約90% 以上的直徑小于2cm 的SPN為非癌性的[2]。常見的惡性病變?yōu)轺[癌、肺腺癌、單發(fā)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移灶等。在全球范圍內(nèi)，肺癌是癌癥發(fā)病率和死亡率最高的疾病，2018 年全世界有210 萬新增和180 萬死亡肺癌病例，約占惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/5( 18. 4%)[3]。在我國，肺癌的發(fā)病率與死亡率也居于首位，于2017 年我國國家癌癥中心公布最新的數(shù)據(jù)顯示，無論大中小城市，肺癌發(fā)病率與死亡率處于全國排名第一[4]。惡性SPN 是肺癌早期表現(xiàn)，隨著人們健康意識的提高、科技的發(fā)展，低劑量螺旋CT 應(yīng)用于檢查的普遍性，很大程度上提高了0.2% 至50% 左右的SPN 檢出率[5]。研究證實進(jìn)行肺部結(jié)節(jié)早期良惡性的篩查及制定相應(yīng)的治療方案，可降低大概20% 的肺癌死亡率[6]。因此，對惡性SPN 精準(zhǔn)的評價十分重要。

1 胸部CT

胸部CT 是SPN 良惡性鑒別診斷有價值的無創(chuàng)性檢查之一[7]。是重新評估胸部X 線檢查可見的肺結(jié)節(jié)并持續(xù)監(jiān)測結(jié)節(jié)大小變化的影像學(xué)檢查手段，惡性SPN 的CT 影像特征通常包括：不規(guī)則或尖刻的邊界可伴有分葉及毛刺、一般為非鈣化或偏心鈣化（在類癌、骨惡性腫瘤肺轉(zhuǎn)移等約2%-13%的惡性SPN 中有鈣化情況）、密度呈磨砂樣（不均勻）、直徑最大1cm 以上、位于肺上葉、胸膜凹陷和血管集束征等[8]。SPN 大小是鑒別良惡性的關(guān)鍵，可為獨立危險因素[9]。惡性SPN沒有明確特異性的影像特征，因而需通過SPN 大小，邊界，密度，鈣化和生長等特征預(yù)測惡性腫瘤。

2 增強(qiáng) CT

快速的靜脈注射 ( 濃度：300mg/m L；速度：2mL/sec) 碘化造影劑，結(jié)節(jié)強(qiáng)化后小于15HU 高度提示良性可能性大；強(qiáng)化超過20HU，則反映結(jié)節(jié)含新生血管，提示惡性可能。增強(qiáng)CT 局限于易將炎性病變誤診為惡性，也易發(fā)生小結(jié)節(jié)測量誤差等。有研究[10]指出惡性SPN 可被動態(tài)增強(qiáng)CT 檢出的敏感性大于95%。

3 MRI

MRI 對異常組織的分辨力高，對軟組織以及血管顯影的清晰度高，對其內(nèi)部血液流動敏感[11]。MRI 增強(qiáng)對惡性SPN 的診斷有一定的幫助，但因心跳呼吸等運動偽影等影響，臨床上很少應(yīng)用MRI 診斷肺部結(jié)節(jié)性質(zhì)。

4 PET-CT

PET-CT 可檢測肺部結(jié)節(jié)的代謝狀態(tài)。由于腫瘤細(xì)胞代謝活躍，攝取顯像劑能力較正常細(xì)胞顯著，因此在惡性病變細(xì)胞早期尚未產(chǎn)生解剖結(jié)構(gòu)變化前，即能發(fā)現(xiàn)隱匿的微小病灶(大于5mm)。PET-CT 的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性較CT 更高[12]。其敏感性及特異性根據(jù)SPN 結(jié)節(jié)性質(zhì)的不同而改變。研究報道指出雖然PET-CT 在病灶有炎癥反應(yīng)時可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，對早期腺細(xì)胞癌診斷亦可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但其對于直徑大于8mm 的實質(zhì)惡性SPN 的診斷價值很高[13]。

5 痰液細(xì)胞學(xué)檢測

根據(jù)痰液病理中脫落癌細(xì)胞對SPN 性質(zhì)作出診斷。因陽性率低，假陰性率高是痰涂片檢查的弊端，臨床上很少能通過痰細(xì)胞學(xué)檢查對早期惡性SPN 進(jìn)行診斷。隨著科技不斷發(fā)展，DNA 痰液檢測技術(shù)提高了惡性SPN 的診斷的陽性率。

6 傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物

腫瘤標(biāo)志物在SPN 中較正常組織可出現(xiàn)異常高值[14]。目前常見腫瘤標(biāo)志物包括癌胚抗原( carcinoembryonic antigen，CEA)、胃泌素釋放肽前體( progastrin releasing peptide，Pro-GRP)、神 經(jīng) 特 異 性 烯醇 化 酶 ( neurone specific enolase，NSE)、細(xì) 胞 角 蛋白19 片段抗原21- 1( cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21- 1)、糖 類 抗 原 ( carbohydrate antigen，CA) 125、鱗狀細(xì)胞癌抗原( squamous cell carcinoma antigen，SCC- Ag)、鐵蛋白等。有研究指出，CEA 有必要與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測提高診斷的敏感性，原因是其單獨檢測對肺結(jié)節(jié)性質(zhì)診斷的特異性較高，敏感性較低[15]；NSE 常用于小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的診斷及相關(guān)治療效果監(jiān)測[16]；Pro-GRP 是SCLC 首選的腫瘤標(biāo)志物，對SCLC 診斷的敏感性和特異性較NSE 更高[17]，因此Pro-GRP 和NSE可以聯(lián)合應(yīng)用于SCLC 的早期診斷；血清CYFRA21-1在肺鱗癌中與其他類型肺癌相比水平明顯升高[18]，Qu 等[19]的一項回顧性研究發(fā)現(xiàn)，惡性與非惡性SPN中血清CYFRA21-1 存在顯著差異，因此可用于肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的診斷[20]；惡性肺結(jié)節(jié)患者血清SCC- Ag 水平較良性肺結(jié)節(jié)患者明顯升0 高，若聯(lián)合監(jiān)測血清SCC- Ag、CEA、 NSE 和 CYFAR21- 1 等 水 平，診 斷的敏感性和特異性更高[21]，目前尚無研究證據(jù)顯示單獨應(yīng)用血清SCC- Ag 水平升高用于肺結(jié)節(jié)診斷的特異性；賈國華等[22]研究指出，CA125 單獨用于診斷肺癌的靈敏度（17.11%），特異度（97.56%）；CA125、CEA、NSE 和 CYFRA21- 1 聯(lián)合檢測惡性肺結(jié)節(jié)的靈敏度為72.37%、特異度 73.17% 、準(zhǔn)確度為72.65%；Sukiennicki[23]等針對肺癌患者和正常人群的血清鐵蛋白水平的對照研究顯示，肺癌患者血清鐵蛋白水平顯著高于正常人群; 且血清鐵蛋白水平與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)，在惡性病變患者血清鐵蛋白水平較正常人群及良性病變患者均有升高，可作為臨床評估惡性肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的潛在標(biāo)志物[24]。因腫瘤標(biāo)志物表達(dá)受多種因素影響，故多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方法對惡性SPN 的診斷仍存在很大的不穩(wěn)定性，仍然需要繼續(xù)尋找更為高效、穩(wěn)定判斷出惡性SPN 的無創(chuàng)方法。

7 免疫學(xué)標(biāo)志物

腫瘤特定抗原或腫瘤相關(guān)抗原( tumorassociatedantigens，TAAs)。TAAs 自身抗體可在惡性肺結(jié)節(jié)早期階段檢測出，TAAs 自身抗體較TAAs 在血清中可穩(wěn)定、高水平的長時間存在，因此TAAs 自身抗體可以用來診斷評估惡性肺結(jié)節(jié)[25]。特定的TAAs 自身抗體常常出現(xiàn)在無癥狀病變早期，可在CT 檢查結(jié)果無法評估診斷之前出現(xiàn)異常值。國外當(dāng)前應(yīng)用于臨床的TAAS 自身抗體譜包括p53、性別決定基因家族2、蛋白基因產(chǎn)物9.5、黑色素瘤抗原A1、CAGE、GBU4-5G、抗原 - 7 抗體等 7 種，Jett 等[26]研究顯發(fā)現(xiàn)，基于以上自身抗體診斷肺癌的特異度可達(dá)91%，靈敏度可達(dá)37%，陽性預(yù)測值可達(dá)16%。Massion 等[27]研究顯示，以上7 種腫瘤自身抗體譜對直徑在4～20mm 肺結(jié)節(jié)性質(zhì)檢測的準(zhǔn)確性有顯著的升高。Sullivan 等[28]研究指出，TAAs 自身抗體對肺癌和早期惡性肺結(jié)節(jié)的診斷具有較高價值。一項對中國人群的臨床研究表明，應(yīng)用以上7 種TAAs 自身抗體對肺結(jié)節(jié)性質(zhì)診斷的靈敏度和特異度分別為61%和90%[29]。多個研究表明，以上免疫標(biāo)志物可與CT 聯(lián)合應(yīng)用提高對肺結(jié)節(jié)性質(zhì)評估的準(zhǔn)確性，但以上TAAs 自身抗體無特異性，在其他腫瘤以及其相關(guān)免疫性疾病中亦可升高，仍存在一定的局限性，此外，由于肺癌質(zhì)性的差異，單一的TAAs 自身抗體對于檢測肺癌類型還存在不足。

8 RNA 相關(guān)標(biāo)志物

微RNA( microRNA，miRNA) 是真核生物調(diào)控非編碼基因的RNA，miRNA 通過調(diào)控原癌和抑癌基因的表達(dá)作用，導(dǎo)致惡性腫瘤相關(guān)miRNA 水平改變。有研究發(fā)現(xiàn)，惡性較良性肺結(jié)節(jié)患者血清中miR-21-5p 和miR-574-5p 呈高水平表達(dá)[20]，Shen 等[30]研究指出，孤立性肺結(jié)節(jié)組miR-21 和miR-210 水平明顯升高，而惡性肺結(jié)節(jié)組較健康組及良性肺結(jié)節(jié)組miR-486-5p 呈低水平表達(dá)，因此，肺結(jié)節(jié)惡變相關(guān)的血miRNA水平對早期惡性肺結(jié)節(jié)的診斷有一定的指導(dǎo)價值。

9 DNA 甲基化

DNA 甲基化是基因轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。DNA 甲基化水平的改變經(jīng)常在人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)，包括肺癌[31-32]。早于2005 年，德國海涅大學(xué)的Schmiemann V 等提出了檢測基因甲基化異常狀態(tài)診斷早期惡性肺部病變[33]。明顯的肺癌惡性表型較DNA 甲基化相對滯后[34]，基因甲基化一般發(fā)生在癌前病變和癌變早期，因此DNA 甲基化可以作為腫瘤早期及惡性SPN 診斷的理想標(biāo)志物。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞釋放DNA 進(jìn)入血液，在體液中可以檢測出某些基因的甲基化，因此DNA 甲基化可應(yīng)用外周血取樣[35]。有研究指出，病變組織及外周血樣本中的某種DNA 甲基化檢測結(jié)果水平大致相同[36]。因此非常適合無創(chuàng)檢測惡性病變的早期診斷。多種DNA甲基化可以用作肺癌早期診斷的有前途的生物標(biāo)記，例 如 p16，RASSF1A，APC，DAPK，RARβ ，CDH13，RUNX3，SHOX2 和 PTGER4 等。

p16 基因，是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4 的抑制劑，細(xì)胞中p16 純合子基因異常狀態(tài)致使細(xì)胞增殖異常，引起惡性病變。研究表明，吸煙者中該基因甲基化存在增高趨勢，與良性肺部病變患者相比惡性患者中p16 基因甲基化呈高水平表達(dá)，肺腺癌相比肺鱗癌患者中p16 啟動子甲基化率明顯增高。在這個研究中顯示p16 基因甲基化參與了肺癌的發(fā)病機(jī)制，并且是惡性SPN 病變的危險因素[37]。

RASSF1A 是Ras 家族的基因之一，與人類腫瘤中Ras 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活有關(guān)，是重要的抑癌基因，調(diào)控細(xì)胞周期，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[38]。RASSF1A 基因啟動子區(qū)域的高度甲基化可以下調(diào)該基因，使RASSF1A 失去抑癌功能，從而可誘發(fā)惡性病變。RASSF1A 在癌癥早期進(jìn)展中就開始發(fā)揮作用。RASSF1A 的異常甲基化已在肺癌中報道[39-40]。

抑癌基因APC，該基因啟動子區(qū)過度甲基化導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)的異常，以至于細(xì)胞惡性增殖及分化，甚至細(xì)胞無法正常凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。Feng 等[41]研究顯示，APC 基因在肺癌中的甲基化率為22.0%，Huang等[42]對151 項研究進(jìn)行的薈萃分析示惡性肺部結(jié)節(jié)患者血清中該抑癌基因甲基化率較良性肺部疾病患者顯著增高。

死亡相關(guān)蛋白激酶（death associated protein, DAPK）[43]是一類多基序鈣調(diào)控的絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶。DAPK 可以正調(diào)控細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞自噬等生理過程。DAPK 的功能障礙及失活可使細(xì)胞異常增殖，導(dǎo)致細(xì)胞惡性病變。DAPK 基因的啟動子基因的甲基化水平程度根據(jù)惡性腫瘤細(xì)胞的而不同而改變。

維甲酸受體β（Retinoic acid receptor-beta，RARβ）基因位于3p24 號染色體，這是肺癌中經(jīng)常缺失的區(qū)域，誘導(dǎo)其表達(dá)可以抑制癌變。曾有研究報道，在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中經(jīng)常觀察到RARβ 甲基化程度高，Song X[44]等報道，與非惡性肺組織相比，NSCLC 中RARβ 啟動子的高度甲基化顯著增加，并且在非典型類癌（atypical carcinoid，AC）中占主導(dǎo)地位，這表明RARβ 甲基化有助于NSCLC（特別是AC）的發(fā)展。

T- 鈣黏蛋白( T-Cadherin/H-Cadherin, CDH13)是一種新型鈣黏蛋白分子。有研究指出，很多不同惡性腫瘤細(xì)胞中CDH13 CPG 島的甲基化以及CDH13 基因表達(dá)沉默，而正常組織中CDH13mRNA 表達(dá)顯著增高，提示其表達(dá)減少或缺失可能與癌變有關(guān)。多項研究表明，CDH13 的再表達(dá)可抑制腫瘤的生長和侵襲[45]。通常CDH13 啟動子的甲基化常發(fā)生在癌癥病變的早期。相比肺鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌其甲基化率明顯增高[42]。

RUNX3 位于人類染色體1p36 上，該區(qū)域長期以來被認(rèn)為是各種腫瘤中的抑癌基因。RUNX3 主要表達(dá)沉默和失活。在各種腫瘤相關(guān)文獻(xiàn)中報道了由于DNA 高甲基化導(dǎo)致RUNX3 失活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)展。包括肺癌等[46]。RUNX3 在肺癌中更頻繁地甲基化，并且RUNX3 甲基化發(fā)生在早期。

矮小同源盒2（short stature Homeobox 2，SHOX2）基因是抑癌基因，主要作用是修復(fù)DNA；SHOX2 高度異常甲基化使其抑癌功能沉默導(dǎo)致癌變[47-48]。2010 年，Schmidt 等[49]首次發(fā)現(xiàn)SHOX2 甲基化對鑒別肺部良惡性病變有這一定價值。在惡性肺結(jié)節(jié)組織，結(jié)節(jié)周圍淋巴結(jié)、支氣管灌洗液，胸腔積液及血漿中均檢測到SHOX2 甲基化呈高表達(dá)[50-53]。

前列腺素E 受體4( PTGER4)，該基因缺失、沉默和失活可抑制非小細(xì)胞肺癌的生長，其過度表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的生長和侵襲有關(guān)[54]，聯(lián)合SHOX2 基因檢測可提高惡性肺部病變的檢出率[55]。PTGER4 是前列腺素E2（PGE2）配體之一，前列腺素E2 是環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase- 2，COX- 2)的生物活性產(chǎn)物，PGE2 可通過與PTGER4 配體結(jié)合來發(fā)揮生理功能，參與細(xì)胞增殖、組織侵襲、血管生成及凋亡等多種過程[56-57]，在許多實驗系統(tǒng)中指出COX-2 和PTGER4 在多種癌前病變和腫瘤組織中過度表達(dá)[55,58]，可導(dǎo)致預(yù)后不良[59]。PTGER4 的激活增加癌細(xì)胞侵襲能力[60]。

Weiss 等[55,61]發(fā)現(xiàn) SHOX2 聯(lián) 合 PTGER4 基 因甲基化的檢測對鑒別SPN 良惡性有顯著作用。其曲線下面積（AUC）為0.88。靈敏度為90% 時，特異度為73%，特異度為90%時，靈敏度為67%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物檢測。以上實驗研究表明，對聯(lián)合DNA 甲基化水平檢測結(jié)果分析，有較高的特異性，對惡性SPN的臨床診斷提供了可避免有創(chuàng)操作的檢驗方法。有相關(guān)研究表明，惡性肺部結(jié)節(jié)發(fā)生的不同時期伴隨著不同抑癌基因的甲基化[62]，故僅憑一種基因甲基化檢測結(jié)果對SPN 性質(zhì)進(jìn)行診斷尚不準(zhǔn)確。隨著基因甲基化檢測技術(shù)的成熟，使甲基化檢測更穩(wěn)定和更便宜，可以完善更多基因的甲基化檢測。綜上所述，DNA 甲基化可以作為有效診斷惡性肺部病變的新型標(biāo)志物。

10 其他

分泌型磷脂酶A2-Ⅱa，肝細(xì)胞生長因子，血清蛋白質(zhì)組生物學(xué)標(biāo)志物片段，循環(huán)腫瘤細(xì)胞，p53 抗體[63-64]等均對惡性肺結(jié)節(jié)性質(zhì)的評估有一定價值，但其預(yù)測肺結(jié)節(jié)良惡性的敏感性以及特異性較差，尚缺乏更多臨床的有效驗證。

11 總結(jié)及展望

惡性SPN 患者預(yù)后好與差，決定于早期對惡性SPN 的精確診斷。雖然外周血多基因甲基化聯(lián)合檢測在惡性SPN 無創(chuàng)診斷中的地位呈上升趨勢，但因各級醫(yī)院醫(yī)療條件有限，可進(jìn)行該檢驗的患者仍處于少數(shù)范圍，基因甲基化缺乏實用性，以及對于非惡性SPN 患者基因異常甲基化的預(yù)后和通過手術(shù)切除惡性病灶后基因甲基化有無改變等的問題，仍然需要長期隨訪。隨著中國政治經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對健康的認(rèn)識越來越全面，這種觀念不僅存在經(jīng)濟(jì)富裕群眾中，而是面向全社會的人民群眾，大多因影像檢查發(fā)現(xiàn)較小SPN的患者是否進(jìn)一步檢查（基因甲基化等），取決于就診當(dāng)?shù)蒯t(yī)院的醫(yī)療條件以及檢測價位?？蛇M(jìn)一步建立包含臨床體征、外周血DNA 甲基化、影像學(xué)特征等對體積較小的SPN 良惡性評估更為精準(zhǔn)的預(yù)測模型，進(jìn)而對惡性SPN 進(jìn)行預(yù)測，根據(jù)預(yù)測結(jié)果，選擇是隨訪觀察還是盡早手術(shù)切除等最佳的干預(yù)措施，盡量避免盲目有創(chuàng)手術(shù)及病理活檢等過度醫(yī)療，把握治療最佳時期。