地中海貧血實驗室診斷技術(shù)最新進展

陳棟，彭小媚，林永恩，陳善昌

(廣西賀州市人民醫(yī)院檢驗科，廣西 賀州)

0 引言

地中海貧血(簡稱地貧)疾病分為輸血依賴型地中海貧血和非輸血依賴型地中海貧血。該分類基于患者的臨床嚴重程度，確定他們是否確實需要定期輸血才能生存。地中海貧血的兩個主要類別是α 和β 地中海貧血，然后將其分為其他子類別，這取決于珠蛋白鏈的缺陷和潛在的分子缺陷，目前尚無有效的治療方法。地貧最常見于東南亞和南亞，中東，然而，鑒于持續(xù)的遷徙，地貧現(xiàn)在在北歐和北美也變得越來越普遍。就我國患病情況來看，地貧在廣東、廣西、四川多見，長江以南各省區(qū)有散發(fā)病例，北方則少見。

因此，使用準確、高效、適用的地貧篩查和診斷方法，將有利于臨床對該病的診斷和適當治療，并且還能引導(dǎo)患者進行婚前檢查及后面的產(chǎn)前診斷，避免重癥地貧患兒的出生，起到預(yù)防及優(yōu)生優(yōu)育的作用，對社會人口健康發(fā)展有著重要指導(dǎo)意義。目前實驗室診斷技術(shù)主要包括地貧的篩查方法和基因診斷技術(shù)。正確的實驗室診斷技術(shù)對于鑒別不同形式表征的地貧至關(guān)重要，對預(yù)防，診斷和治療具有重要意義。本文就地中海貧血實驗室診斷技術(shù)最新進展進行綜述。

1 地中海貧血篩查方法

1.1 血紅蛋白電泳技術(shù)

血紅蛋白是由兩對多肽鏈組成，每一條鏈含有血紅素和絡(luò)合鐵原子的卟啉，血紅蛋白的蛋白稱為珠蛋白。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)，分子特性不同是由于其肽鏈氨基酸順序和性狀改變造成。血紅蛋白(Hb)電泳是最常用的評估方法。不同的血紅蛋白(例如HbA，HbA2 和HbS)具有不同的電荷，這使它們通過電場在凝膠中以不同的速度運動。Hb 蛋白中的畸變會改變其電荷，這可以通過其在凝膠中遷移速度的變化來識別。在堿性條件下，以瓊脂糖凝膠電泳方式進行，電泳待凝膠干燥后，肉眼可直接判斷條帶有無異常。運用掃描儀檢測可準確定量分析電泳條帶的異常情況。有報道稱，當血紅蛋白HbA2＜2.5%時，則高度懷疑是α 地貧基因攜帶者，如果發(fā)現(xiàn)了HbH 包涵體，則為中間型α 地貧。其余類型增多則無法直接判斷，但可作為β 地貧的排除性診斷[1]。

1.2 血液學(xué)檢查

地貧作為隱性疾病，通過血液學(xué)檢查來識別地貧的攜帶者是必不可少的。α 或β 地中海貧血攜帶者( 雜合子) 均表現(xiàn)為小細胞低色素性貧血，紅細胞形態(tài)和網(wǎng)織紅細胞計數(shù)有助于將地中海貧血患者與其他血液病患者區(qū)分開來，而最常見的缺鐵性貧血是最需要鑒別診斷以排除的[2]。在測定鐵蛋白或原卟啉鋅之后，調(diào)查家族史可能為地中海貧血的實驗室診斷提供有用的信息[3]。血液學(xué)參數(shù)包括血紅蛋白含量、平均血紅蛋白含量、紅細胞體積分布寬度、平均紅細胞體積及平均血紅蛋白濃度等。每當檢測到缺鐵時，在明確診斷之前，必須先補充鐵后再重復(fù)血液學(xué)參數(shù)檢測。在大多數(shù)地中海貧血攜帶者中都可以檢測到紅細胞的形態(tài)變化：最典型的變化是小紅細胞增多癥，色素減退和異紅細胞增多癥(紅細胞大小和形狀的變化)。

1.3 高效液相色譜技術(shù)

高效液相色譜技術(shù)(HPLC)是采用分離率高的離子交換層析法進行自動快速血紅蛋白分析的。最近，陽離子交換高效液相色譜已成為檢測許多Hb 亞型的流行方法，是一種靈敏度高，特異性強，重復(fù)性高的電泳替代方法，故HPLC 被國際地貧協(xié)會推薦作為β 地貧常規(guī)篩查方法。其檢測結(jié)果可對血紅蛋白組分中的HbA2，HbF 準確定量，同時還能檢測到HbBart’s，HbH，提示患者有α 地貧，對β 地貧也可以作出準確的診斷。HPLC 同時還可對地貧基因無法查出的多種異常血紅蛋白病作出診斷。

然而，盡管地貧的高效液相色譜技術(shù)有逐漸被基因診斷所替代的趨勢，但在實驗室條件缺乏、非典型突變或是復(fù)雜類型的地貧患兒的診斷中，高效液相色譜技術(shù)對地貧的診斷依然具有非常重要的地位[4]。

2 地中海貧血的基因診斷技術(shù)

依據(jù)分子生物學(xué)基礎(chǔ)的基因診斷技術(shù)，正在臨床被廣泛地應(yīng)用。研究表明約5% 的β 地貧及約95% 的α 地貧是由于基因缺失引起的。DNA 分子診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于地中海貧血。當前，有許多不同的基于PCR 的技術(shù)可用于診斷已知的珠蛋白基因突變，以及用于鑒定未知突變的其他方法。傳統(tǒng)的印記雜交技術(shù)，是用顯影技術(shù)顯示不同的DNA 位置及其含量大小，從而判斷基因片段的缺失與否，可作為α 地貧基因缺失型診斷的金標準[5]。但由于操作繁瑣，檢測時間長已逐漸被取代。目前地貧檢測最常用的方法是聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)[6]。

2.1 以PCR 為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)

2.1.1 反向斑點雜交技術(shù)

反向斑點印跡技術(shù)已被廣泛使用，其中擴增的DNA 與固定在尼龍條上的一組突變特異性探針雜交，通過分子雜交及顯色反應(yīng)，觀察膜條信號的有無，判斷探針與產(chǎn)物的雜交與否，從而確定待檢樣本的基因型。對于β 地中海貧血突變，反向斑點印跡技術(shù)更是在臨床被廣泛使用。

2.1.2 裂隙聚合酶鏈反應(yīng)

裂隙聚合酶鏈反應(yīng)(gap polymerase chain reaction，Gap-PCR)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于α 地貧的檢測，其特點是高特異性和高靈敏度，在大樣本、多突變位點篩查上比傳統(tǒng)非均一性方法更方便、性價比更高，相比定量探針法突變分析和其他類型快速突變分析法，應(yīng)用面更廣，成本更低[7]，其原理是兩端設(shè)計一對引物，利用引物間距過遠，超出有效擴增范圍而不能生成擴增產(chǎn)物。大片段缺失的存在會使斷端連接，上下游引物靠近，生成特定擴增產(chǎn)物[8]。由于α珠蛋白基因簇內(nèi)的序列同源性很高，因此α 珠蛋白基因簇中的序列擴增比β 珠蛋白基因簇中的擴增困難。α 地中海貧血主要是由于不同長度的缺失所致，可以通過Gap-PCR 優(yōu)先檢測。已經(jīng)公開了引物序列以診斷幾種α+或α°[9-11]，近年來該檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床。歐陽紅梅等[12]對云南少數(shù)民族地區(qū)新生兒α 地貧基因，以Gap-PCR、熒光定量PCR 熔解曲線法檢測，攜帶率為9.0%。唐笑等人[13]對湖南地區(qū)的7914 例樣本采用Gap-PCR 法進行α 地貧基因缺失檢測，檢出率為17.44%。戴慶福等[14]對7823 例血常規(guī)指標異常的病人采用Gap-PCR 檢測3 種缺失型α 地貧，攜帶率為15.66%。Gilad 等[15]也選擇Gap-PCR 檢測常見的缺失型α 地貧，該方法具有較高的檢出率，對臨床診斷意義重大，被實驗室廣泛應(yīng)用檢測。Gap-PCR 法還能診斷β 地貧大片段基因的缺失。已知有200 多種β 地貧突變，其中大多數(shù)是單核苷酸取代，插入或短缺失，大多數(shù)可以通過Gap-PCR 診斷出來[16]。然而，Gap-PCR 的結(jié)果判讀需電泳，易造成污染，且繁瑣，不適于檢測大量樣本[17]。

2.2 基因芯片技術(shù)

地中海貧血基因診斷芯片是一種基于芯片檢測地貧基因突變的新技術(shù)，它能同時檢測α 與β 地貧基因突變類型?；蛐酒捎梦⒘奎c樣或是光導(dǎo)原位合成等方法，將生物分子作為探針固定于支持物表面，然后與已標記的待測分子進行雜交，通過激光共聚焦掃描對雜交信號的強度進行檢測，從而對該分子的數(shù)量和性質(zhì)進行分析。該技術(shù)能準確快速地從分子水平診斷該疾病，在地貧的基因診斷方面應(yīng)用前景廣闊。地中海貧血基因芯片診斷體系，DNA 測序的改進和成本的降低使得基因芯片在許多實驗室中得到了最廣泛的應(yīng)用，僅用病人一點血液標本，就可以分析出基因的確切核苷酸序列或所評估的基因區(qū)域，可以準確判斷病人是否攜帶地貧致病基因，準確快速地對中國人常見的8 種地貧突變進行分子學(xué)診斷。

2.3 多重連續(xù)探針擴增技術(shù)

多重連續(xù)探針擴增技術(shù)是依賴探針來進行的擴增技術(shù)，可檢測約50 個位點的拷貝數(shù)變異[18]。其原理是把目的基因復(fù)制到探針上，再用引物擴增捕獲片段，再對片段進行電泳分析得出結(jié)果。引入多重連續(xù)依賴性探針擴增，由于它的靈敏性和可靠性，現(xiàn)在可以使用該方法代替Southern 印跡，而無需使用放射性檢測[19]。

2.4 高通量測序

在Sanger 測序時代之后，下一代測序(NGS)代表了測序技術(shù)的新原理。一次分析即可將測序能力從幾百個堿基對增加到幾千個。NGS 基于克隆擴增的DNA 分子的大規(guī)模并行測序，再加上足夠的計算能力和用于高效數(shù)據(jù)分析的適當軟件，已將遺傳學(xué)診斷以可承受的價格引入了臨床實踐[20]。它可以應(yīng)用于整個基因組，整個外顯子組和到基因組的特定目標區(qū)域。目前，在文獻中，沒有關(guān)于用這種方法對球蛋白基因進行測序的數(shù)據(jù)。只有一個商業(yè)測序小組可用，報告包括HbB 和HbA1 基因。

NGS 的最關(guān)鍵步驟是用于DNA 捕獲的探針集的實驗設(shè)計：α和β 簇中基因之間的高度同源性使NGS 治療地中海貧血的方法非常困難，耗時且昂貴，NGS 的另一個關(guān)鍵點是，它可用于檢測單核苷酸取代，插入或小缺失，但對于其他類型的基因組變異而言卻不那么準確。盡管現(xiàn)在生物信息學(xué)的研究也正在研究用于檢查是否存在復(fù)雜的重排的工具，但現(xiàn)在遺漏了大的缺失或三聯(lián)，尤其是在α 地中海貧血的情況下，這使整個過程完全無用。

總之，重要的是要強調(diào)，不需要DNA 分析球蛋白基因突變即可診斷大多數(shù)攜帶者狀態(tài)。建議了解TDT 的診斷，了解父母突變，以及在NTDT 病例中，不同球蛋白基因缺陷的共存性可能導(dǎo)致不同的表型表達。

由于存在輕度突變或α 和β 地貧相互作用，即使通過家庭血液學(xué)評估，有些病例在血液學(xué)和臨床上也難以診斷；因此，在這種情況下，在開始治療之前進行分子分析很方便。

絨毛膜絨毛DNA 的分析是產(chǎn)前診斷的方法，根據(jù)實驗室的設(shè)施和專業(yè)知識，所使用的方法與突變檢測的方法相同。產(chǎn)前診斷的必要步驟是切除任何母體組織，因為母體殘留組織的存在可能會導(dǎo)致診斷錯誤。為了排除母體污染，通過PCR 檢測胎兒和父母DNA 樣品中的短串聯(lián)重復(fù)序列或可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列是必不可少的[21]。

3 小結(jié)

地中海貧血是最常見的隱形遺傳病，目前無有效的治療方法，大部分靠輸血為生，不僅加重患者的家庭負擔，還影響人類素質(zhì)的優(yōu)生優(yōu)育。不過有報道稱，目前造血干細胞移植(HSCT)仍是該疾病的唯一綜合治療方法，在重型地中海貧血中，與HLA 匹配的家庭供體仍被認為是金標準的造血干細胞移植(HSCT)，在骨髓或臍帶血移植后均取得了優(yōu)異的效果[22]。但費用昂貴，且難找到匹配的供體，不是一般家庭所能承受的。

目前實驗室檢測地貧比較常見的技術(shù)是血紅蛋白電泳，Gap-PCR 和反向斑點雜交技術(shù)，但不管是哪一種方法，都有它的局限性，存在漏檢等，影響檢出率。而多重連續(xù)探針擴增技術(shù)、基因芯片技術(shù)、高通量測序等技術(shù)成本較高，不適于大規(guī)模樣本，但隨著科學(xué)技術(shù)進步在不斷的完善當中，相信這些技術(shù)能發(fā)展的更好，同時我相信不久的將來會有更好的地貧檢測技術(shù)出現(xiàn)，從而更好的服務(wù)患者，造福人類。