CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù):基因剪刀—重寫生命密碼的工具
——2020年諾貝爾化學(xué)獎簡介

谷思宇 楊曉梅 賀俊崎

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)系，北京 100069)

1 獲獎?wù)吆喗?/h2>

1.1 埃瑪紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)

Emmanuelle Charpentier (圖1)，1968年12月11日出生于法國奧爾日河畔瑞維西。本科就讀于巴黎第六大學(xué)(UPMC)，后進(jìn)入巴斯德研究所攻讀博士學(xué)位(1986-1995)。1996-1997年，分別于巴黎巴斯德研究所和紐約洛克菲勒大學(xué)進(jìn)行博士后研究。2002年，在維也納建立自己的實(shí)驗(yàn)室。2009年6月赴瑞典于默奧微生物研究中心繼續(xù)研究，8月她的小組通過實(shí)驗(yàn)探明了CRISPR系統(tǒng)的機(jī)制。2011年之后與杜德納合作發(fā)展CRISPR技術(shù)?，F(xiàn)就職于德國柏林馬克斯·普朗克病原學(xué)研究室。

1.2 詹妮弗·杜德納(Jennifer A.Doudna)

Jennifer A.Doudna(圖2)，1964年出生于美國華盛頓特區(qū)。1895年,Doudna獲得波莫納學(xué)院學(xué)士學(xué)位，1989年，獲得哈佛大學(xué)博士學(xué)位，畢業(yè)后于麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院進(jìn)行分子生物學(xué)博士后研究?，F(xiàn)為美國加州大學(xué)伯克利分校教授，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員。

圖2 Jennifer A.Doudna

2 主要科學(xué)貢獻(xiàn)：建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)

自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)以來，用于制造和操縱DNA的技術(shù)已在生物學(xué)上取得了進(jìn)步。1972年，P.Berg構(gòu)建了第一個DNA重組分子，標(biāo)志著生物基因工程的核心的開始。但在細(xì)胞和生物體的基因組中引入位點(diǎn)特異性修飾仍然難以實(shí)現(xiàn)。在CRISPR/Cas9技術(shù)用于基因組編輯之前，科學(xué)家們開發(fā)了使用DNA-蛋白質(zhì)識別原理的鋅指核酸酶(ZFNs)和TAL效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)進(jìn)行基因編輯。然而ZFN基因編輯有很強(qiáng)的局限性，不能識別任意目標(biāo)基因序列，并且識別序列經(jīng)常受上下游序列影響。TALEN 技術(shù)利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，克服了ZFN方法的不足，但在構(gòu)建過程中，TALE 分子的模塊組裝和篩選過程比較繁雜，需要大量的測序工作。對于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低。因此，迫切需要一種高效、易操作的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

1987年，Nakata博士領(lǐng)導(dǎo)的課題組在K12大腸桿菌中研究其目的基因iap時偶然間發(fā)現(xiàn)了一段串聯(lián)間隔重復(fù)序列，且這些重復(fù)序列被含32個堿基的序列間隔開，而當(dāng)時并不清楚這種序列的生物學(xué)意義[1]。2002年，Jansen博士領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型的重復(fù)DNA序列家族，且該家族只存在于原核生物中，在真核生物及病毒中卻不存在，這種序列被稱為規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并在含CRISPR的原核生物中發(fā)現(xiàn)了4個與CRISPR相關(guān)的(cas)基因(cas1,cas2,cas3,cas4)，且cas基因始終位于CRISPR基因座附近[2]。2005年，Mojica博士等多位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間隔序列來自于外來噬菌體或質(zhì)粒，病毒無法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細(xì)胞，而易侵入那些沒有間隔序列的細(xì)胞，由此他們提出CRISPR可能參與細(xì)菌的免疫功能的假說。2007年，這一假說被Danisco 公司的兩位科學(xué)家——Rodolphe Barrango和Philippe Horvath所證實(shí)。他們發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌中存在 CRISPR 序列，能夠幫助細(xì)菌識別、抵抗噬菌體DNA的侵入[3]。

2011年，本次諾獎得主之一 的Emmanuelle Charpentier博士發(fā)現(xiàn)了CRISPR基因編輯系統(tǒng)的最后一塊拼圖-tracrRNA，由此CRISPR系統(tǒng)最終可以實(shí)現(xiàn)定向剪切目標(biāo)基因[4]。隨后Emmanuelle Charpentier博士與另一位諾獎得主Jennifer A.Doudna博士合作研究CRISPR基因編輯系統(tǒng)在試管中精確切割DNA，2012年，兩人將CRISPR-Cas9的研究成果公之于眾。同時，這兩位科學(xué)家所帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)純化出了Cas9蛋白，發(fā)現(xiàn)了Cas9 的切割作用和crRNA 的定位作用，并首次利用這個系統(tǒng)對特定DNA分子在體外進(jìn)行靶向切割化學(xué)反應(yīng)，顯示出CRISPR在活細(xì)胞中修改基因的能力。她們是最早從事把細(xì)菌天然免疫系統(tǒng)演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具研究的科學(xué)家，她們?yōu)樵摷夹g(shù)后續(xù)的應(yīng)用勾勒出基本的框架和路線。

隨后，麻省理工學(xué)院的華人科學(xué)家張鋒和來自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的George Church改進(jìn)了技術(shù)，成功地將 CRISPR-Cas9系統(tǒng)運(yùn)用到真核生物(哺乳動物)細(xì)胞中[5]，使人們開始認(rèn)識到這一技術(shù)的變革性力量，由此極大地推動了CRISPR/Cas9技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的推廣和應(yīng)用。張鋒和他所在的Broad研究所在美國擁有CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于所有真核生物——包括植物、動物和人類的專利，這是CRISPR技術(shù)商業(yè)化最為核心的專利之一。

麻省理工學(xué)院教授Phillip Sharp(1993年諾獎得主)曾表示：Charpentier、Church、Doudna和張鋒是建立CRISPR基因編輯技術(shù)最重要的貢獻(xiàn)者。然而基于諾獎傳統(tǒng)最多頒給三人的傳統(tǒng)習(xí)俗，他們無法共享諾獎。因而他認(rèn)為一個比較合理的組合是：諾貝爾化學(xué)獎頒給Doudna和Charpentier，以彰顯她們在CRISPR/Cas9技術(shù)建立過程中生物化學(xué)方面的研究成就；生理或醫(yī)學(xué)獎頒給Church和張鋒，以彰顯他們在活體細(xì)胞中成功建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，為該技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用鋪平了道路。因此2020年諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，作為該技術(shù)的初創(chuàng)者，她們獲獎是實(shí)至名歸。對于此次錯失諾貝爾獎，Church博士坦然接受并認(rèn)為諾貝爾委員會做出了“一個非常明智的選擇”。他認(rèn)為他們中的任何一個人都不會因?yàn)闆]有獲得諾貝爾獎而受到輕視。在他看來Charpentier和Doudna做出了一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，這是委員會授予她們諾貝爾獎的原因，而他和張鋒更像是技術(shù)發(fā)明家。他甚至還打趣說：“如果有人想獲得如何不獲得諾貝爾獎的任何技巧，那很容易?！?“通過專注于發(fā)明，我已經(jīng)謹(jǐn)慎地避免了所有此類煩惱?！?他還說，張鋒仍很年輕，“張鋒充滿了創(chuàng)意，我毫不懷疑他將來會獲得一兩個?！?/p>

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理

CRISPR是細(xì)菌中成簇存在的被規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是一種古老的抵御病毒入侵的方式。在噬菌體感染細(xì)菌時，噬菌體的一段 DNA序列，會整合入細(xì)菌的CRISPR重復(fù)序列中，當(dāng)該噬菌體再次入侵時，那么這個免疫系統(tǒng)會被激活，來干擾噬菌體DNA。CRISPR 序列會轉(zhuǎn)錄出一段與先前整合的那段噬菌體DNA序列互補(bǔ)的 RNA，即 CRISPR RNA (crRNA)，然后 crRNA、Cas蛋白核酸酶組成CRISPR/Cas系統(tǒng)，特異性識別并切割噬菌體DNA[6](圖3)。

圖3 CRISPR干擾的免疫過程[6]

根據(jù)參與作用的Cas蛋白基因的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三種類型[7]，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的標(biāo)記基因分別為Cas3(屬于解旋酶家族成員) 和Cas10(具有和核酸聚合酶以及核酸環(huán)化酶同源的結(jié)構(gòu)域)，除此之外還需要多種相關(guān) Cas 蛋白，基因編輯系統(tǒng)較為復(fù)雜[8](圖4)。而Ⅱ型CRISPR-Cas是三種類型中最簡單的系統(tǒng)，僅需要一種Cas9蛋白[9]。

目前使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，crRNA和tracrRNA被組合在一起改造成向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)，指導(dǎo)Cas9蛋白定點(diǎn)切割DNA序列。該系統(tǒng)需要在靶標(biāo)DNA上有一段保守的前間隔區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)作為搜索目標(biāo)。對于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)一般為5-NGG-3′序列，一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解鏈，sgRNA與DNA互補(bǔ)，Cas9對靶序列進(jìn)行定點(diǎn)剪切。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用前景、挑戰(zhàn)與爭議

4.1 應(yīng)用前景

在過去的幾年內(nèi)，研究人員已成功地將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用到多種生物中,極大地促進(jìn)了生物基因組功能的研究。

4.1.1 植物和動物

通過基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)對植物多基因調(diào)控性狀的改良，如耐寒、抗旱和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品系的篩選培育。如WRINKLED(WRI)在大豆油脂合成積累中具有關(guān)鍵作用，閆麗[10]利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過抑制轉(zhuǎn)基因受體植株中內(nèi)源基因GmWRI11a的表達(dá)，創(chuàng)制大豆GmWRI1a基因突變體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因突變體植株中糖酵解和脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量下降，解析了該基因在調(diào)控大豆種子油脂合成中的作用。在動物研究方面，CRISPR 基因編輯技術(shù)已被成功應(yīng)用于小鼠、大鼠、斑馬魚、果蠅和猴子等的基因組編輯。

4.1.2 醫(yī)學(xué)

基因編輯技術(shù)已經(jīng)用于藥物研發(fā)、疾病治療和異體器官移植等。如四川大學(xué)華西醫(yī)院胸部腫瘤科盧鈾教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了首次CRISPR-Cas9基因編輯的人體臨床試驗(yàn)，并于2016年10月進(jìn)行了首例受試者治療，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在體外T細(xì)胞中編輯PD-1基因，經(jīng)體外T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，再輸回非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)受試者，首次證明了該療法在NSCLC中的安全性和可行性[11]。

4.2 挑戰(zhàn)與爭議

4.2.1 脫靶效應(yīng)及倫理問題

2018年11月26日，前南方科技大學(xué)副教授賀建奎宣布一對名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒于11月在中國健康誕生，由于這對雙胞胎的一個基因(CCR5)經(jīng)過修改，她們出生后即能天然抵抗艾滋病病毒(HIV)。這一消息瞬間震動了世界?！盎蚓庉媼雰骸笔录砸鹕鐣?qiáng)烈關(guān)注，一方面是因?yàn)樵摷夹g(shù)的不確定性，脫靶效應(yīng)這一有爭議的問題一直影響著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，會給受試者和嬰兒均帶來巨大的健康隱患，另一方面則更多的是因?yàn)榇嬖趥惱韱栴}，這種行為肆意踐踏基因編輯技術(shù)臨床應(yīng)用的倫理底線，違背有關(guān)人類受試者試驗(yàn)研究的基本規(guī)范，編輯人類生殖細(xì)胞基因可能會帶來無法預(yù)知的災(zāi)難性后果，出于安全風(fēng)險、社會及醫(yī)學(xué)倫理等方面的考慮，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用仍有待嚴(yán)格規(guī)范。

4.2.2 專利之爭

持續(xù)多年的CRISPR專利爭奪主要在Broad研究所的張鋒團(tuán)隊(duì)與加州大學(xué)伯克利分校的Doudna團(tuán)隊(duì)之間展開。雖然加州大學(xué)伯克利分校率先在歐洲專利局提交了關(guān)于將CRISPR技術(shù)用于cell-free系統(tǒng)中專利的申請，但是張鋒和Broad研究所搶先一步在美國獲得了真核細(xì)胞CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專利授權(quán)，而這正是該技術(shù)最有應(yīng)用前景的領(lǐng)域。加利福尼亞大學(xué)一方于2017年4月對這項(xiàng)裁決提起上訴，稱他們的原始應(yīng)用覆蓋了所有細(xì)胞、植物、動物和人類，而不是只局限于細(xì)菌的基因編輯。2018年9月份，美國聯(lián)邦巡回上訴法院裁定，維持美國專利審判與上訴委員會的判決。張鋒和Broad研究所將繼續(xù)擁有在真核生物中使用CRISPR基因編輯的知識產(chǎn)權(quán)。Doudna博士雖然沒有贏得真核細(xì)胞CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專利授權(quán)，但是此次榮獲諾貝爾獎，也是失之東隅,收之桑榆。

5 小結(jié)

2012年，Jennifer A.Doudna和Emmanuelle Charpentier兩位教授向 《科學(xué)》投文“the Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to cleave any double-stranded DNA sequence”，僅用了20天編輯部就接受了該文。這篇文章標(biāo)志著對CRISPR/cas9系統(tǒng)的最后技術(shù)突破，為CRISPR作為基因編輯工具的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2020年10月7日，僅8年時間，兩位教授就摘取了諾貝爾獎桂冠。這主要?dú)w功于基因編輯CRISPR-Cas9技術(shù)的重要性和影響力。如今，CRISPR/Cas9技術(shù)已滲透到生命科學(xué)學(xué)科的各個領(lǐng)域。也為整個科研界一場深刻的革命奠定了基礎(chǔ)。