一株鴨源貝萊斯芽孢桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

張小波， 溫貴蘭*， 張喜懿， 陳 廣， 楊 穎

(1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是由Cristina Ruiz-García等[1]在2005年分離并命名的菌種，廣泛存在于自然界中。王金燕等[2]在刺參池塘中分離出1株貝萊斯芽孢桿菌，并對其進行了安全性試驗，結(jié)果表明刺參狀態(tài)良好，采食正常，無其他異常反應(yīng)。連彩等[3]認為，不同貝萊斯芽孢桿菌菌株的形態(tài)與理化特征不盡相同，作為芽孢桿菌的1個新菌種還有待繼續(xù)研究。近年來由于某些芽孢桿菌的營養(yǎng)特性及耐受特性等有益于動物腸道健康和促進消化，被作為1種益生菌而廣泛應(yīng)用于禽業(yè)及水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)。本試驗在分離致病菌時偶然從發(fā)病花邊鴨肝臟組織中分離到1株芽孢桿菌，通過16S rRNA序列分析鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，并進行藥敏試驗，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病鴨來源花邊鴨4只，來自貴州省遵義市某養(yǎng)鴨場。

1.1.2 主要試劑LB固體培養(yǎng)基、革蘭氏染料、抗菌藥敏紙片(購自杭州微生物試劑有限公司)，新生胎牛血清(購自海博生物有限公司)，2×EsTaqDNA 聚合酶(購自康為世紀有限公司)，DL 2 000 Marker[購自寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察無菌操作從病鴨肝臟、脾臟取樣，用接種環(huán)接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，挑取優(yōu)勢單個菌落進行純培養(yǎng)[4]。挑取純培養(yǎng)菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察分離菌形態(tài)特征。

1.2.2 分離菌16S rRNA PCR擴增及測序以分離純化后的菌液為模板，使用細菌通用16S rRNA引物進行PCR擴增。上游引物F：5’-AGAGTTT GATCMTGGCTCA-3’；下游引物R：5’-TACG GYTACCTTGTTACGACT-3’。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(預(yù)擴增片段1 450 bp)。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×EsTaqDNA 聚合酶12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，菌液2 μL，dd H2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。將所測分離菌的16S rRNA與GenBank數(shù)據(jù)庫的參考菌株16S rRNA (見表1)進行BLAST同源性比對，利用生物學(xué)軟件Megalign構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表1 參考菌株信息

1.2.3 分離菌藥敏試驗取菌液100 μL用無菌棒均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基中，根據(jù)臨床常用抗生素選定24種藥物(多粘菌素B、紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、苯唑西林、氨芐西林、米諾環(huán)素、頭孢呋辛、頭孢他啶、克林霉素、頭孢拉定、青霉素、氧氟沙星、丁胺卡那、諾氟沙星、頭孢哌酮、卡那霉素、麥迪霉素、萬古霉素、哌拉西林、羧芐西林、多西環(huán)素、四環(huán)素、慶大霉素)將藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑，參照《抗菌藥物敏感試驗標準》(WS/T 125—1999)進行藥物敏感性判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離純化及形態(tài)觀察經(jīng)純培養(yǎng)后，在接種肝臟組織的LB固體培養(yǎng)基長出乳白色、不透明、中等大小、表面粗糙、邊緣不光滑的黏液樣菌落；染色鏡檢分離菌為革蘭氏陽性短小桿菌。

2.2 分離菌16S rRNA PCR擴增及測序用細菌通用16S rRNA引物對分離菌進行PCR擴增，出現(xiàn)1 450 bp左右目的條帶(見圖1)，經(jīng)測序后拼接長度為1 460 bp；系統(tǒng)進化樹分析顯示其與貝萊斯芽孢桿菌處于同一分支，與大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌、金黃色葡萄球菌相距較遠(見圖2)。由此鑒定分離菌為貝萊斯芽孢桿菌(命名為GZZY2019)。

2.3 藥敏試驗應(yīng)用紙片法對分離細菌進行藥物敏感試驗，從表2可見：該菌對紅霉素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等15種藥物敏感，對丁胺卡那、哌拉西林、四環(huán)素3種藥物中敏，對多粘菌素B、苯唑西林等6種藥物耐藥。

表2 分離菌藥敏試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗從發(fā)病花邊鴨肝臟組織中分離的細菌經(jīng)鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(命名為GZZY2019)，可作為動物源貝萊斯芽孢桿菌菌株的后續(xù)相關(guān)研究素材。

4 討論

某些芽孢桿菌具有改善動物腸道微生態(tài)平衡、促進動物生長、提高免疫力和減少相關(guān)疾病等多重益生功效，是目前動物飼料中應(yīng)用最廣泛的1種益生菌[5]。本次分離的鴨源貝萊斯芽孢桿菌按臨床常用的24種抗生素進行藥敏試驗顯示對多粘菌素B、苯唑西林等6種藥物耐藥，對其他抗生素都有不同程度的敏感性。已有研究表明芽孢桿菌類的地衣芽孢桿菌對常見的多種抗生素均敏感，可避免動物體內(nèi)微生物之間抗生素抗性的轉(zhuǎn)移，因而減少部分微生物對其產(chǎn)生耐藥性[6]。也有研究表明貝萊斯芽孢桿菌通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物和抗菌蛋白等產(chǎn)生很好的抑菌作用[7]。本次分離的鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019菌株是否也有類似作用以及是否為致病菌株尚需進一步研究。