馬立克氏病病毒貴州株meq基因的克隆及遺傳進(jìn)化分析

張喜懿， 溫貴蘭*， 歐德淵， 陳 廣， 張小波， 汪德生， 文 明， 胡 璇， 孫 蕓， 劉蔓蔓

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2. 貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550016)

馬立克病(Marek’s disease，MD)是由馬立克病病毒 (Marek’s disease virus，MDV)引起雞的1種淋巴組織增生性疾病，其特征是病雞的外周神經(jīng)、虹膜、各內(nèi)臟器官形成腫瘤病灶[1]。Josebp Marek于1907年首次報(bào)道該病，Campbell J G等1961年正式將該病命名為雞馬立克氏病[2]。Churchill A E等[3]1967年首次從接種病雞細(xì)胞的培養(yǎng)物中分離出MDV。此后世界各地相繼報(bào)道有馬立克病的發(fā)生和流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。MDV共有3種血清型，即血清1型(MDV-1)、血清2型 (MDV-2)、血清3型 (MDV-3)，但只有MDV-1可致瘤或致病[5]。根據(jù)MDV-1致病性的強(qiáng)弱，又可將其分為溫和型(mild MDV，mMDV)、強(qiáng)毒型(virulent MDV，vMDV)、超強(qiáng)毒型(very virulent MDV，vvMDV)、特超強(qiáng)毒MDV(very virulent plus MDV，vv+MDV)[6]。相關(guān)研究表明，與MDV致腫瘤相關(guān)的基因有meq、132-bpr、pp38/pp24、v-IL8等，而132-bpr基因與Meq基因是MDV-1所特有的，其中meq基因是公認(rèn)的主要致瘤基因，與MDV-1強(qiáng)弱毒株致瘤性的不同有關(guān)[7，8]。本試驗(yàn)從疑似MD貴州矮腳黃雞的肝臟病料中擴(kuò)增出MDVmeq基因片段，并對(duì)該片段進(jìn)行克隆及遺傳進(jìn)化分析，為豐富貴州省MDV毒株信息庫(kù)及防控MD提供參考。

1 材料

1.1 檢測(cè)病料肝臟病料采自貴陽(yáng)市某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的疑似MD矮腳黃雞，保存于貴州大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(-80 ℃冰箱)。

1.2 主要試劑瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒[購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司]，HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒(購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司)，質(zhì)粒提取試劑盒、2×ESTaqDNA Mix、pMD19-T Vector、DL 2 000 DNA Marker、DL 5 000 DNA Marker[購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司]，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 主要儀器電泳槽(DYCZ-HOB型)、電泳儀電源(DYCZ-8C型)(購(gòu)自北京市六一儀器廠)，SYGENE電泳凝膠成像儀(購(gòu)自GENE公司)，多功能梯度PCR儀(VeritiTm 96-Well Thermal Cycler)(購(gòu)自ABI公司)，37 ℃隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(BD53)(購(gòu)自BINDER公司)。

2 方法

2.1 引物信息參考GXY2株meq基因(GenBank登錄號(hào)：EF546430)設(shè)計(jì)MDVmeq，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

2.2 MDV核酸PCR檢測(cè)根據(jù)病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書分別提取總DNA和總RNA，再根據(jù)HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。使用MDVmeq特異引物對(duì)核酸樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系20 μL：上、下游引物(10 mol/μL)各1.0 μL，2×ESTaqDNA聚合酶10 μL，核酸2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性45 s，60.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。

2.3 MDVmeq基因克隆將MDVmeq的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～24 h至長(zhǎng)出菌落，挑取6個(gè)單菌落接種于含氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃ 170 r/min培養(yǎng)12～16 h。取培養(yǎng)的克隆菌液2 μL進(jìn)行PCR鑒定(反應(yīng)體系及條件同2.2)，提取陽(yáng)性克隆菌液質(zhì)粒送華大基因測(cè)序。

2.4 MDVmeq基因遺傳進(jìn)化分析將測(cè)序結(jié)果與GenBank中已有序列進(jìn)行比對(duì)，利用MegAlign軟件分析其同源性、氨基酸缺失位點(diǎn)，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。參考毒株信息見表2。

表2 MDV meq基因參考毒株信息

3 結(jié)果

3.1 MDV核酸檢測(cè)結(jié)果由圖1可見：經(jīng)PCR擴(kuò)增，于1 020 bp處出現(xiàn)MDVmeq基因特異擴(kuò)增條帶，長(zhǎng)度與預(yù)擴(kuò)增片段相符，表明病雞存在MDV感染，將該片段命名為MDV GZ 2019meq。

3.2 MDVmeq基因克隆菌液PCR鑒定結(jié)果由圖2可見：各克隆菌液在1 020 bp處均出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，與目的基因大小相符。

3.3 MDV GZ 2019meq基因同源性分析測(cè)序結(jié)果顯示MDV GZ 2019meq基因全長(zhǎng)1 020 bp，共編碼339個(gè)氨基酸，將其與GenBank登錄的10株MDV參考株的meq基因進(jìn)行核苷酸序列、推導(dǎo)氨基酸序列同源性比對(duì)。由圖3可見：MDV GZ 2019meq基因與參考毒株的核苷酸同源性為98.7%～99.8%。其與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.8%)，與國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒MDV分離株J-1株、美國(guó)特超強(qiáng)毒MDV分離株648A株的同源性最低(98.7%)。由圖4可見：MDV GZ 2019meq基因與參考毒株的推導(dǎo)氨基酸同源性為96.7%～99.4%。其與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的同源性最高(99.4%)，與荷蘭溫和型MDV分離株CVI988株的同源性最低(96.7%)。

3.4 MDV GZ 2019meq基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹分析由圖5可見：MDV GZ 2019meq基因與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的親緣關(guān)系最近，與美國(guó)特超強(qiáng)毒MDV分離株TK株、N株、648A株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3.5 MDV GZ 2019meq基因推導(dǎo)氨基酸序列分析將MDV GZ 2019meq基因推導(dǎo)氨基酸序列與GXY2等10株參考毒株進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)(見圖6)。除第63位氨基酸突變是MDV GZ 2019meq基因所獨(dú)有以外，其余突變位點(diǎn)與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株完全一致。

4 討論

4.1meq基因是MDV-1中特有的主要致腫瘤基因，關(guān)于該基因的國(guó)內(nèi)外報(bào)道較多，但其致瘤機(jī)制目前仍不清楚[9]。meq基因相對(duì)保守，在不同致病力毒株之間其核苷酸和氨基酸序列的同源性均較高。本試驗(yàn)中MDV GZ 2019meq基因的核苷酸、推導(dǎo)氨基酸同源性分析結(jié)果表明，其與10株不同致病力MDV參考毒株的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列同源性分別為98.7%～99.8%、96.7%～99.4%。強(qiáng)毒株MDVmeq基因全長(zhǎng)1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸；而疫苗弱毒株(如CVI988株、814株)的meq基因在第575～577位有3個(gè)堿基缺失(即CAC)，導(dǎo)致了1個(gè)脯氨酸的缺失[10]。本試驗(yàn)分離的MDV GZ 2019meq基因長(zhǎng)度為1 020 bp，在第575～577位不存在堿基缺失，與大部分強(qiáng)毒株的特性一致，說(shuō)明其具有強(qiáng)毒株的特征。

4.2相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，低致病力MDV毒株具有脯氨酸重復(fù)區(qū)，而強(qiáng)毒株第153位、176位、217位的脯氨酸存在突變，破壞了meq基因原有的脯氨酸重復(fù)區(qū)，導(dǎo)致了致病力的變化[11]。本試驗(yàn)中MDV GZ 2019meq基因共有5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，分別在第63位(R→G)、第80位(D→Y)、第139位(T→A)、第176位(P→R)、第217位(P→A)，其中第176位和217位氨基酸的突變破壞了脯氨酸重復(fù)區(qū)，具有強(qiáng)毒株特性；此外，除第63位氨基酸突變是MDV GZ 2019meq基因所獨(dú)有以外，其余突變位點(diǎn)均與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株完全一致，故推測(cè)其為強(qiáng)毒株。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)從疑似MD貴州矮腳黃雞的肝臟病料中擴(kuò)增出MDVmeq基因，并進(jìn)行克隆及序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因長(zhǎng)度為1 020 bp，可編碼339個(gè)氨基酸；與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株的核苷酸序列同源性高達(dá)99.8%；存在5個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)，除第63位突變是MDV GZ 2019meq基因所獨(dú)有以外，其余突變位點(diǎn)均與國(guó)內(nèi)特超強(qiáng)毒MDV分離株GXY2株完全一致，推測(cè)其為強(qiáng)毒株，具體致病性強(qiáng)弱還需進(jìn)一步研究。