人結(jié)直腸癌組織CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞與患者預(yù)后的關(guān)系

傅超，梅婷婷，汪鴻濤，陶勇，王東，裘建明，楊關(guān)根

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州第三醫(yī)院 肛腸外科，浙江 杭州 310009；2.寧波市第一醫(yī)院 肛腸外科，浙江 寧波 315000）

結(jié)直腸癌是常見的高度惡性的消化道腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)致死率依然居高不下[1]。診斷時(shí)常已是中晚期，預(yù)后不佳。因此，找到新的腫瘤標(biāo)志物及時(shí)發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良高?；颊撸恢笔茄芯康臒狳c(diǎn)與難點(diǎn)。研究證實(shí)腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞（tumourinfiltrating T lymphocytes，TILs）可改變腫瘤微環(huán)境，參與或抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[2]。目前發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]、膀胱癌[6]等實(shí)體惡性腫瘤存在差異性改變，并可預(yù)測(cè)其預(yù)后，但對(duì)于結(jié)直腸癌預(yù)測(cè)研究的報(bào)道甚少。因此，本研究探討分析CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及其預(yù)后的關(guān)系，并評(píng)價(jià)其作為一項(xiàng)預(yù)后標(biāo)志物的可能性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 入選標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均初次接受標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)直腸癌手術(shù)治療；②術(shù)后病理確診為結(jié)直腸癌，且根據(jù)AJCC第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)；③未接受其他任何靶向抗腫瘤、新輔助放化療等治療；④排除各種免疫系統(tǒng)疾病如血液病等；⑤排除合并其他惡性腫瘤患者。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，收集2012年1月至2014年1月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市第三醫(yī)院肛腸科收治的行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的109例結(jié)直腸癌患者臨床病理資料及術(shù)后標(biāo)本。其中男71例，女38例，年齡32～78歲。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過，患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑:鼠抗人CD4+單克隆抗體（購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司）；鼠抗人CD8+單克隆抗體（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）；抗鼠IgG抗體（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè):①109例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片厚5 μm，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化，枸櫞酸緩沖液高溫修復(fù)抗原。以0.3%過氧化氫-甲醇孵育10 min，以阻斷清除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS漂洗4次滴加5% BSA封閉液，室溫孵育60 min，傾去。滴加一抗1:50鼠抗人CD4+、CD8+單克隆抗體，4 ℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗后。再滴加二抗抗鼠IgG抗體，室溫孵育20 min，PBS漂洗。DAB顯色15 min，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。②結(jié)果判讀:通過光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Olympus公司）分析特定免疫細(xì)胞染色浸潤(rùn)的程度。CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的量化標(biāo)準(zhǔn):腫瘤組織中上皮細(xì)胞浸潤(rùn)＞5%為高表達(dá)，浸潤(rùn)≤5%為低表達(dá)，CD4+/CD8+為兩者同時(shí)高表達(dá)。

1.3 隨訪計(jì)劃 采用門診或電話對(duì)所有患者進(jìn)行為期5年的隨訪，截止時(shí)間為2019年1月。隨訪研究的主要終點(diǎn)是無病生存率（disease-free survival，DFS），定義為從手術(shù)之日起至第1次出現(xiàn)局部或者區(qū)域復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、隨訪終止或死亡時(shí)間；總生存率（overall survival，OS），定義為手術(shù)之日至出現(xiàn)任何原因引起的死亡時(shí)間或隨訪終止。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法對(duì)2組患者之間臨床病理特征進(jìn)行比較。采用Kaplan-Meier分析方法繪制生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)比較分組生存率的差異。運(yùn)用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素預(yù)后分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平及分組免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)高水平78例，低水平31例；CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)高水平56例，低水平53例，見圖1。

2.2 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平與腫瘤分期、浸潤(rùn)深度密切相關(guān)（P＜0.05）；而與年齡、性別、腫瘤位置及大小等無關(guān)（P＞0.05）。同時(shí)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T淋巴細(xì)胞密切相關(guān)（P＜0.05），而與腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+T淋巴細(xì)胞無關(guān)（P＞0.05）。見表1。

2.3 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+T淋巴細(xì)胞水平與結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后分析 109例結(jié)直腸癌患者隨訪，其中失訪10 例（其中包括非腫瘤相關(guān)死亡病例）。生存曲線分析顯示，高水平CD8+及CD8+/CD4+結(jié)直腸癌患者的DFS和OS較好（P＜0.05）。而CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)直腸癌患者的DFS、OS與低水平組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞水平（×200）

表1 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的Cox單因素及多因素分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者預(yù)后DFS和OS與腫瘤分期、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD4+、CD8+及CD8+/CD4+密切相關(guān)（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05）。將上述預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行多因素Cox回歸分析，顯示腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD8+及CD8+/CD4+均為結(jié)直腸癌患者術(shù)后DFS和OS預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），同時(shí)浸潤(rùn)深度僅為DFS預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表2。

3 討論

圖2 腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生存曲線

表2 影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的Cox單因素及多因素分析

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段與多基因變異積累的、復(fù)雜的病理演變過程，涉及到腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的增殖和凋亡、機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視、腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸等多個(gè)環(huán)節(jié)[7]。研究證實(shí)，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)在機(jī)體有效清除腫瘤原發(fā)病灶、防止腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用。其中，腫瘤特異性CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞效應(yīng)功能受損或呈耗竭時(shí)表現(xiàn)為促炎細(xì)胞因子的生成減少，對(duì)抗原的刺激反應(yīng)性低[8]。因此，CD4+及CD8+可能成為惡性腫瘤的新生物標(biāo)志物和判斷治療及預(yù)后的細(xì)胞靶點(diǎn)。

本研究通過對(duì)結(jié)直腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平明顯高于癌旁組織?，F(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在惡性腫瘤組織中的浸潤(rùn)程度，以及淋巴細(xì)胞亞群的比例變化，影響預(yù)后生存[9]。已有研究表明，淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度可能與結(jié)直腸癌形成等有一定的相關(guān)性[10]，與我們的研究結(jié)果一致。同時(shí)，進(jìn)一步分析CD4+及CD8+腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，提示CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞水平與腫瘤分期、浸潤(rùn)深度密切相關(guān)（P＜0.05）。運(yùn)用Kaplan-Meier及Log-Rank檢驗(yàn)分析，高水平CD4+、CD8+及其CD4+/CD8+結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好，與以往研究[11]相一致。進(jìn)一步推測(cè)CD4+及CD8+腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞變化可能改變腫瘤微環(huán)境免疫平衡，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，影響腫瘤預(yù)后。本研究還通過Cox回歸單因素及多因素分析亦發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CD8+及CD4+/CD8+均為結(jié)直腸癌患者術(shù)后DFS和OS預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。因此，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞可作為評(píng)價(jià)術(shù)后患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和總生存率的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

目前認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞是強(qiáng)有力的、對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用的細(xì)胞，可抵抗腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移，承擔(dān)著腫瘤的免疫監(jiān)視作用[12]。T淋巴細(xì)胞主要分為CD4+T亞群及CD8+T淋巴細(xì)胞亞群，其比例和功能等特征在一定程度上反映了機(jī)體抗腫瘤反應(yīng)的總體水平。CD4+T細(xì)胞亞群主要包括Th1細(xì)胞亞群、Th2細(xì)胞亞群、Th17細(xì)胞亞群、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等，各特異性亞群的功能不同，部分在宿主防御反應(yīng)和免疫介導(dǎo)的疾病中起著決定性的作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)Thl細(xì)胞亞群和幾乎所有類型的癌癥改善的臨床結(jié)果有強(qiáng)烈的關(guān)系[14]。另外，以表達(dá)CD4+/CD25+/FoxP3+為特征的Treg細(xì)胞能夠抑制T細(xì)胞的免疫功能并能干擾免疫療法的作用[15]。CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的主要淋巴細(xì)胞亞群，表現(xiàn)為細(xì)胞毒性效應(yīng)。一方面，它能夠通過分泌細(xì)胞毒性顆粒如穿孔素、顆粒酶和細(xì)胞表面受體如TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）來殺傷腫瘤細(xì)胞，承擔(dān)免疫防御和免疫監(jiān)視的功能[16]。另一方面，識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的特異性抗原，且在Th細(xì)胞的幫助下活化，進(jìn)一步殺傷腫瘤細(xì)胞[17]。因此，本研究中CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)可在一定程度上反映抗腫瘤免疫功能，可作為預(yù)測(cè)遠(yuǎn)期生存的標(biāo)志。

關(guān)于CD4+T淋巴細(xì)胞水平是否有利于癌癥患者預(yù)后的評(píng)估仍存在相當(dāng)大的爭(zhēng)議。研究表明高CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的膀胱癌患者，其預(yù)后較差[18]。而另一研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的程度和患者的預(yù)后呈明顯正相關(guān)[19]。本研究創(chuàng)新性采用CD4+聯(lián)合CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)綜合比較分析預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后，并作為評(píng)價(jià)DFS及OS獨(dú)立因素之一。目前，廣泛被接受的假說是癌癥患者的預(yù)后取決于浸潤(rùn)的CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的比值。CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，以維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能的穩(wěn)定。改變了組織局部免疫微環(huán)境，免疫抑制加重，免疫監(jiān)視功能減弱，有利于腫瘤細(xì)胞增殖，從而有利于腫瘤的進(jìn)展、侵襲或轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)論表明，CD4+、CD8+表達(dá)下降提示結(jié)直腸癌患者預(yù)后更差，在一定程度上與上述結(jié)論相符合。

綜上所述，CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)水平對(duì)結(jié)直腸癌患者預(yù)后的評(píng)估有重要指導(dǎo)價(jià)值，但其機(jī)制等仍有待進(jìn)一步研究。此外，此研究對(duì)于尋找結(jié)直腸癌治療的免疫療法有很大的提示意義。