甲基汞暴露致學(xué)習(xí)記憶功能障礙作用機(jī)制的研究進(jìn)展

張 力，張愛華，王文娟*

(貴州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

汞(Hg)是一種有毒的重金屬元素，被世界衛(wèi)生組織列為對(duì)公眾健康危害最大的10 種化學(xué)品之一。 甲基汞(methylmercury，MeHg)在所有汞化合物中毒性最強(qiáng)[1]。甲基汞主要是汞化合物在水體環(huán)境中通過微生物的轉(zhuǎn)化作用而自然產(chǎn)生的一種有毒化合物，其通過食物鏈傳遞，進(jìn)行高度的生物富集[2]。由于甲基汞具有親脂性，易通過胎盤屏障，胎兒和新生兒極易受到甲基汞的毒性損害，因此，發(fā)育過程中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)十分脆弱，是甲基汞毒性的主要靶點(diǎn)[3]。

甲基汞作為一種針對(duì)神經(jīng)發(fā)育的毒性物質(zhì)，其毒性機(jī)制和毒性效應(yīng)一直引起人們的廣泛關(guān)注。震驚全球的日本水俁病事件揭示了長(zhǎng)期暴露在高毒性的甲基汞環(huán)境中會(huì)導(dǎo)致機(jī)體感覺障礙、共濟(jì)失調(diào)等各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病；先天甲基汞中毒的胎兒可見廣泛的腦部病變且表現(xiàn)出腦癱和嚴(yán)重發(fā)育遲緩的癥狀[4]。

眾所周知，大腦的學(xué)習(xí)記憶是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，目前甲基汞暴露對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制尚不明確。本文就甲基汞早期暴露致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用機(jī)制進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能受損，被認(rèn)為是甲基汞神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。谷胱甘肽系統(tǒng)在維持大腦的氧化平衡方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)[5]，宮內(nèi)甲基汞暴露會(huì)破壞出生后仔鼠大腦中谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的發(fā)育，導(dǎo)致谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性下降。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在控制活性氧(reactive oxygen species，ROS)過度產(chǎn)生方面發(fā)揮著重要作用，Liu等[6]研究表明，甲基汞可致細(xì)胞內(nèi)SOD的活性呈劑量依賴性下降。因此，甲基汞通過抑制細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，進(jìn)而誘發(fā)ROS產(chǎn)生并作用于線粒體。

線粒體富含硫醇蛋白質(zhì)，它不僅是甲基汞蓄積的主要場(chǎng)所，還是甲基汞毒性作用的靶向細(xì)胞器[7]。氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)是細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的主要來源，線粒體電子傳遞鏈酶復(fù)合體的活性降低會(huì)導(dǎo)致ATP合成障礙。甲基汞暴露可使線粒體中OXPHOS、電子傳遞鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性下降，線粒體DNA過度損傷，導(dǎo)致ATP合成減少，誘發(fā)線粒體功能障礙，進(jìn)一步促進(jìn)ROS的生成，形成ROS過度生成的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致線粒體應(yīng)激[8]。另外，在神經(jīng)元細(xì)胞中，異常升高的ROS將會(huì)破壞胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致動(dòng)力相關(guān)蛋白1激活、視神經(jīng)萎縮癥蛋白1失活和線粒體碎片化，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，引起學(xué)習(xí)記憶功能障礙[9]。

總之，甲基汞暴露導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性下降，誘發(fā)線粒體應(yīng)激導(dǎo)致線粒體ATP合成功能障礙，ROS過度產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而使神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致大腦的學(xué)習(xí)記憶能力下降。

2 谷氨酸過度激活

谷氨酸作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)2/3 的突觸傳遞，在學(xué)習(xí)記憶、突觸可塑性以及大腦發(fā)育過程發(fā)揮著重要作用[10]，其受體分為離子型和代謝型。其中離子型谷氨酸受體又分為3種亞型：α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙氨酸(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid，AMPA)受體、N-甲基-d-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體和紅藻氨酸(kainic acid，KA)受體。

谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glutamate-aspartate transporter，GLAST)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(glial glutamate transporter-1，GLT-1)是星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸的主要通道，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞外的谷氨酸水平。神經(jīng)細(xì)胞暴露于甲基汞后，由于產(chǎn)生過量的ROS而引起GLAST和GLT-1表達(dá)均明顯下降，由此導(dǎo)致谷氨酸在胞外大量蓄積，從而導(dǎo)致NMDA 受體的過度激活[11]。Beattie等[12]的實(shí)驗(yàn)證明了NMDA 受體的激活可介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流而激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的活化從而誘發(fā)AMPA 受體內(nèi)吞。AMPA 受體的內(nèi)吞導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)程抑制形成而導(dǎo)致突觸的數(shù)量減少，被認(rèn)為是大腦遺忘的分子基礎(chǔ)。

高濃度的Ca2+會(huì)破壞鈣穩(wěn)態(tài)，引發(fā)信號(hào)通路的紊亂，使神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)的活性增強(qiáng)、OXPHOS、線粒體活性失調(diào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化和胞內(nèi)細(xì)胞器功能紊亂[13]。一般認(rèn)為，nNOS活性的增加會(huì)導(dǎo)致一氧化氮(nitric oxide，NO)生成增多，NO合成量的增加被認(rèn)為是一些神經(jīng)退行性病變神經(jīng)元死亡的重要原因[14]。內(nèi)流的Ca2+通過鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)激活nNOS 從而產(chǎn)生過量的NO，其可與·-O2形成具有強(qiáng)氧化毒性的過氧亞硝酸根，因此過量產(chǎn)生的NO最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[15]。

總之，甲基汞暴露導(dǎo)致胞外谷氨酸蓄積，使NMDA受體過度激活，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，誘發(fā)NO的神經(jīng)毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，使學(xué)習(xí)記憶功能受損。

3 NMDAR異常表達(dá)

N-甲基-d-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)是由神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸控制的陽離子通道，主要存在于CNS谷氨酸能突觸的突觸后側(cè)和突觸前側(cè)，被認(rèn)為是學(xué)習(xí)和記憶的基礎(chǔ)，目前已經(jīng)確定的NMDAR 亞基共有7 個(gè)：1 個(gè)NR1、4個(gè)NR2(A、B、C和D)和2個(gè)NR3(A、B)亞基[16]。

當(dāng)CaM增加時(shí)，細(xì)胞會(huì)反饋性調(diào)節(jié)鈣蛋白酶活力增加，暴露于甲基汞后，鈣蛋白酶活力明顯升高，NMDA 受體的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的降低，可能是由于細(xì)胞內(nèi)鈣超載反饋性調(diào)節(jié)鈣蛋白酶活力升高，鈣蛋白酶水解CaM的同時(shí)降解NMDAR，導(dǎo)致NMDAR 表達(dá)下降[17]。王欣梅等[18]證實(shí)了大鼠在出生后第1、2周暴露于甲基汞會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，且NMDAR2 的mRNA 表達(dá)異常，推測(cè)當(dāng)甲基汞誘發(fā)NMDAR 表達(dá)異常特別是NMDAR2 的表達(dá)異常時(shí)會(huì)引起學(xué)習(xí)記憶能力的下降。

4 鐵死亡

2012 年Dixon 等[19]首次發(fā)現(xiàn)了一種新型的細(xì)胞死亡方式——鐵死亡(ferroptosis)，它是一種鐵依賴性的、以細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧(lipid reactive oxygen species，L-ROS)蓄積為特征的細(xì)胞死亡，在細(xì)胞形態(tài)、生化和基因水平方面與細(xì)胞凋亡、壞死和自噬有明顯的差異。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是一種含有硒基的降脂酶，可以降低脂膜中的過氧化物，抑制其活性是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的重要因素之一[20]。研究表明[21]，甲基汞暴露可使GPX4的活性和表達(dá)均降低。GSH對(duì)于GPX4發(fā)揮功能至關(guān)重要，其合成直接影響GPX4活性發(fā)揮，而甲基汞可使細(xì)胞內(nèi)GSH的合成減少。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可與脂質(zhì)膜上的多不飽和脂肪酸相互作用形成可致細(xì)胞死亡的L-ROS，而GPX4 則可抑制L-ROS 的積累，當(dāng)GPX4活性下降則會(huì)導(dǎo)致L-ROS的積累從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[22]。

抑制胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體(cystine/glutamate antiporter system，System Xc-)是誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡的重要機(jī)制[23]。System Xc-是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化體系，可介導(dǎo)谷氨酸的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)和胱氨酸(cystine，CySS)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并參與細(xì)胞內(nèi)GSH 的生物合成。甲基汞暴露引起細(xì)胞外谷氨酸含量過高時(shí)，System Xc-則會(huì)抑制細(xì)胞對(duì)CySS 的攝取，而CySS 是GSH 生物合成的重要物質(zhì)，抑制System Xc-而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CySS 和GSH 含量減少，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元上自由基的積累，最終導(dǎo)致細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生[13]。

鐵死亡的概念自從被提出后便逐漸成為科學(xué)研究的熱點(diǎn)，但是目前關(guān)于甲基汞誘發(fā)細(xì)胞鐵死亡機(jī)制的研究還不夠成熟，因此關(guān)于甲基汞誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶的影響機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討和闡明。

5 自 噬

自噬，又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是一種高度保守的細(xì)胞代謝的過程，由溶酶體介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)組分和細(xì)胞器的降解，在維持細(xì)胞的物質(zhì)能量平衡方面發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為有利于細(xì)胞的存活。既往研究認(rèn)為，在進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞自噬是一種非選擇性的維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的過程，可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，目前研究最廣泛的是巨自噬[24]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target of rapamycin，mTOR)，是一種由人類mTOR 基因編碼產(chǎn)生的蛋白激酶，激活mTOR 抑制自噬，抑制mTOR 激活自噬，激活mTOR 會(huì)下調(diào)空泡型ATP酶的表達(dá)，破壞溶酶體和自噬酸化，引起自噬功能障礙[25]。研究發(fā)現(xiàn)，人神經(jīng)干細(xì)胞暴露于甲基汞(0.01～1 μmol/L)后，mTOR 水平呈劑量依賴性下降，表明甲基汞過度激活自噬，導(dǎo)致自噬系統(tǒng)失調(diào)[26]。不過，目前關(guān)于甲基汞抑制mTOR 表達(dá)的機(jī)制有待探究。

自噬發(fā)生后，自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(light chain 3，LC3)首先被自噬相關(guān)蛋白4(autophagy related protein 4，Atg 4)分解成LC3-Ⅰ(胞質(zhì)形式)，然后Atg4/Atg5/Atg16L 復(fù)合物介導(dǎo)LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合生成LC3-Ⅱ(脂化形式)[27]。甲基汞暴露后細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，則說明自噬活性增強(qiáng)[28]。Fang等[29]研究了自噬在甲基汞誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性中的作用，發(fā)現(xiàn)甲基汞誘發(fā)了細(xì)胞自噬并以濃度和時(shí)間依賴的方式降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的活力，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增加。Lin等[30]研究發(fā)現(xiàn)甲基汞通過增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的自噬促進(jìn)了自噬小體的積累，下調(diào)JNK/Vps34復(fù)合自噬誘導(dǎo)通路可減少自噬小體積累，減少甲基汞誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，證實(shí)了甲基汞暴露導(dǎo)致溶酶體降解功能受損，通過JNK/Vps34復(fù)合通路誘導(dǎo)自噬小體的積累和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

在正常的生理?xiàng)l件下，Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1(Kelchlike ECH-associated protein 1，Keap1)和核因子E2 相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合形成Keap1-Nrf2復(fù)合物，其在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害的方面發(fā)揮著重要作用。當(dāng)Keap1中的巰基被親電性的甲基汞修飾后，Nrf2 被激活，從而導(dǎo)致Nrf2 和Keap1 解離，并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[31]。當(dāng)Nrf2 和Keap1 之間的相互作用被破壞時(shí)，抑制Nrf2蛋白酶體的降解，促使Nrf2在細(xì)胞內(nèi)重新生成，導(dǎo)致Nrf2向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位增加，而核內(nèi)增加的Nrf2可誘導(dǎo)激活抗氧化應(yīng)答元件(antioxidant responsive element，ARE)，進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞免受損害。Yang等[32]實(shí)驗(yàn)表明，Nrf2/ARE通路的激活可保護(hù)星型膠質(zhì)細(xì)胞免受甲基汞的毒性損害。泛素結(jié)合蛋白(ubiquitin binding protein，P62)是一種自噬銜接蛋白，可將自噬和Keap1-Nrf2 通路連接起來[33]。暴露于甲基汞后P62 的表達(dá)增加[34]。增加的P62可與Nrf2競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Keap1，導(dǎo)致Keap1通過自噬而降解，而P62 可再次誘導(dǎo)Nrf2 激活，在P62 和Nrf2之間形成正反饋環(huán)路，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用[33]。P62-Keap1-Nrf2通路可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷，其與細(xì)胞自噬之間有一定的聯(lián)系，但具體機(jī)制有待研究。

目前，國(guó)外關(guān)于該方面的研究甚少，國(guó)內(nèi)亦尚未見系統(tǒng)的報(bào)道，因此關(guān)于甲基汞誘發(fā)細(xì)胞自噬的機(jī)制有待深入探究。

6 表觀遺傳修飾

近年來，表觀遺傳修飾已逐漸成為神經(jīng)發(fā)育研究的熱點(diǎn)，其調(diào)控機(jī)制主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和微小RNA(microRNA，miRNA)調(diào)控。研究表明，在大腦結(jié)構(gòu)如海馬和前額葉皮層中，與突觸可塑性和突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)的一些基因會(huì)由于表觀遺傳修飾的改變而發(fā)生變化[35-36]。

miRNA是一類長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可參與調(diào)控多種基因的表達(dá)。近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)在控制基因表達(dá)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，部分ncRNA通過靶向相關(guān)鐵蛋白來調(diào)節(jié)鐵死亡[37]。MiR-30b-5p是一種來自人胎盤的ncRNA。Zhang 等[38]在子癇前期模型中研究發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-30a-5p的表達(dá)可上調(diào)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而減輕細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。關(guān)于甲基汞致鐵死亡的機(jī)制尚未見詳細(xì)報(bào)道，而對(duì)于ncRNA在鐵死亡中作用的研究更是少之又少，因此未來還需繼續(xù)開展相關(guān)的研究。

DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化下，相關(guān)DNMT催化甲基通過一定的方式轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。研究發(fā)現(xiàn)[39]，抑制NMDA 受體的激活可以阻斷記憶相關(guān)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子DNA的去甲基化，說明了通過NMDA受體傳遞信號(hào)對(duì)于DNA 去甲基化至關(guān)重要，暗示DNA 甲基化是NMDA 受體的一個(gè)靶點(diǎn)目標(biāo)，但這其中更多的機(jī)制還需繼續(xù)深入探究。

神經(jīng)元分化階段被認(rèn)為易受化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的表觀遺傳變化的影響，Go等[40]將組蛋白修飾作為表觀遺傳變化的代表，研究了在體外神經(jīng)元分化模型中，甲基汞導(dǎo)致酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)基因的表觀遺傳抑制。該研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)甲基汞染毒后，與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的組蛋白H3K27me3在多巴胺合成的限速酶TH基因啟動(dòng)子區(qū)的表達(dá)顯著增加，通過增加與TH啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的組蛋白修飾，導(dǎo)致TH表達(dá)顯著降低。

表觀遺傳修飾在學(xué)習(xí)記憶中的調(diào)控機(jī)制已成為神經(jīng)發(fā)育研究的熱點(diǎn)，關(guān)于甲基汞暴露致表觀遺傳修飾改變對(duì)大腦學(xué)習(xí)記憶的影響，尚需進(jìn)一步的研究。

7 展 望

甲基汞的神經(jīng)毒性效應(yīng)及其機(jī)制一直以來都是科研工作者研究的熱點(diǎn)。鐵死亡和自噬在學(xué)習(xí)記憶中的作用機(jī)制也日益受到關(guān)注，然而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于甲基汞誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡和自噬的研究相對(duì)較少，尚有諸多問題需進(jìn)一步探討，今后有望成為研究的重要方向。因此，深入研究上述的幾種機(jī)制可為今后甲基汞暴露致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的研究提供更多科學(xué)依據(jù)，對(duì)今后甲基汞誘發(fā)子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷的防治具有重要意義。